74株CRE酶型分布及對依拉環素體外活性分析

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Distribution of carbapenemase and in vitro sensibility of eravacycline in 74 CRE strains

Yang Huilin， Yan Jinjin，Lu Chang，Ou Jiawen， Zhu Heng， Tian Weijiang，and Ji Ling （DepartmentofClinicalLaboratory，PekinUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036）

AbstractObjectiveToprovidedata support forlaboratory testing，clinical diagnosisandtreatment，infection prevention，and control of carbapenem-resistant Enterobacteriales （CRE），the carbapenemase types and sensibility to the novel antibacterialdrug eravacycline ofCREisolated from Peking University Shenzhen Hospital from2022 to 2023were investigated.MethodsTheclinical distribution and antibiotic susceptibilityof 74 CRE strains were analyzed. Antimicrobial susceptibility tests of eravacycline were performed using the E-test method. Carbapenemase types were detected by the carbapenemase inhibitor enhancement test，colloidal gold immunochromatography technology，andfirst-generationsequencing technologyResultsThe74CREstrains included46strainsofKlebsiella pneumoniae，19 strains of Escherichia coli，and9strains of other Enterobacteriales.The antibiotic susceptibilityof these 74 CRE strains to ceftazidime/avibactam， colistin， and tigecycline was 74.0% ， 91.8% and 98.1% ，respectively. Antimicrobial susceptibility test of eravacycline showed that the sensitive rate of K. pneumoniae was 73.9% with a （204號 MIC₉₀ of 1.00μg/mL ，and the sensitive rate of E coliwas 89.4% with a MIC₉₀ of 0.19μg/mL .Three methods were used to detect carbapenemase; the results of collidal gold immunochromatography and first-generation sequencing were completely consistent， with a positive rate of 70.3% （52/74）. 26 strains （35.1%） of KPC type （bla_KPC） ， 22 strains （20 （29.7%） of NDM type （bla_NDM） ， 3 strains （4.1%） of IMP （bla_MP） type， and 1 strain （1.4%） of OXA-48 type （bla_oxA-48） （204 were detected. The positive rate of the carbapenemase inhibitor enhancement test was 71.6% （53/74）. The consistency rateof the carbapenemase inhibitor enhancement testwas 93.2% compared with the above two methods.And it produced 1 negative results when detecting IMP-producing CRE strains. Conclusion Carbapenem-resistant （204號 K. pneumoniae isolated from Peking University Shenzhen Hospital mainly produced KPC serine carbapenemase， whilecarbapenem-resistant E .colimainlyproduced NDM typemetallo- ?β -lactamase.When detectingIMP metalloβ -lactamase， the carbapenemase inhibitor enhancement test may yield 1 negative results .Eravacycline showed excellent antibacterialactivityagainst CRE.

Key wordsCarbapenem-resistant Enterobacterales; Carbapenemase; Carbapenemase inhibitor enhancement test;Antimicrobial susceptibility test; Eravacycline

耐碳青霉烯腸桿菌目細菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）是指對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的腸桿菌目細菌。按照2022年美國CDC發布的《醫療機構CRE防控指南》，CRE是指對任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥（中介不算耐藥）的腸桿菌目細菌，或檢測到產碳青霉烯酶；部分腸桿菌目細菌如摩氏摩根菌、變形桿菌屬、普羅維登斯菌屬對亞胺培南天然非敏感，則需要對亞胺培南以外的其他碳青霉烯類抗菌藥物耐藥才能判定為CRE[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，CRE檢出率呈上升趨勢，根據中國CHINET網的數據，耐美羅培南肺炎克雷伯菌的分離率，從2014年 14.1% 迅速上升至2023年26.0%^[2] 。CRE對臨床常用抗菌藥物耐藥率高，對臨床用藥帶來巨大挑戰，可用以治療CRE感染的抗菌藥物越來越少。研究CRE的流行病學特點及耐藥機制，有助于其感染診治及防控。相關研究表明，CRE對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制為產碳青霉烯酶[]。本研究對北京大學深圳醫院2022—2023年分離的74株CRE進行臨床分布、主要抗菌藥物耐藥性、碳青霉烯酶酶型分析，并檢測其對新型抗菌藥物依拉環素（eravacycline）的敏感性，評估不同碳青霉烯酶酶型檢測方法的性能，旨在為本地區CRE感染的實驗室檢測、臨床診斷與治療、耐藥菌感染防控，提供數據支持。

1材料和方法

1.1 菌株來源

留取2022年1月—2023年10月北京大學深圳醫院臨床分離的CRE菌株，去重后凍存于 -80‰ 冰箱待用。本研究采用回顧性研究，相關知情同意豁免及倫理審查已獲得醫院倫理委員會審批。

1.2 儀器和試劑

VITEKMS質譜細菌鑒定儀（法國Bio-Merieux）、VITEK2COMPACT全自動微生物鑒定分析系統（法國Bio-Merieux）、黏菌素及替加環素微量肉湯稀釋法試劑條（溫州康泰生物科技有限公司，黏菌素批號：XC29293，替加環素批號：XC0425JA）、依拉環素藥E-Test試劑條（意大利DiagnosticiLiofilchem，批號：090123011）、碳青霉烯酶酶抑制劑緩沖液（上海原科實業發展有限公司，批號：R03230701）、營養瓊脂培養基（廣州迪景微生物科技有限公司，231003D-1）、亞胺培南藥敏紙片（英國Oxoid，批號：3689368）、碳青霉烯酶檢測試劑盒（膠體金免疫層析法，北京金山川生物科技有限公司，批號：20230306）、第一代測序細菌DNA提取試劑盒（FastPure BacteriaDNAIsolationMiniKit；南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.3方法

1.3.1菌種鑒定、藥敏試驗

菌株從 .80^°C 冰箱傳出，使用梅里埃VITEKMS系統進行菌種鑒定，梅里埃VITEK2COMPACT系統進行儀器法藥敏試驗，常規藥敏試驗折點遵循2023年度美國臨床和實驗室標準化協會（clinicallaboratorystandardinstitute，CLSI）M100推薦的判定標準[4]，替加環素藥及依拉環素敏試驗折點標準遵循美國FDA標準[5-6]。黏菌素及替加環素耐藥時，使用微量肉湯稀釋法復核。依拉環素藥敏試驗使用E-test法檢測。

1.3.2 耐藥表型檢測

1.3.2.1碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗法

基于A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內酰胺酶的活性可分別被3-氨基苯硼酸（APB）及乙二胺四乙酸（EDTA）抑制，以檢測A類、B類及OXA-48碳青霉烯酶。調制 1.5×10⁸CFU/mL 待測菌，涂布于MH瓊脂平板，貼4張亞胺培南藥敏紙片，分別標注A/B/C/D，紙片A作為對照，紙片B滴加 10μL APB液，紙片C滴加 10μL EDTA液，紙片D同時滴加 10μL APB液及 10μL EDTA液?？諝猸h境 35°C 培養16～18h后讀取結果。滴加抑制劑紙片的抑菌圈直徑比對照 ?5mm 為陽性。詳細檢測方法參考相關文獻。

1.3.2.2 膠體金免疫層析法

使用膠體金標記的鼠抗碳青霉烯酶單克隆抗體檢測菌株所產的碳青霉烯酶，該實驗能定性檢測菌株培養后產生的KPC（A類）、NDM（B類）、IMP（B類）、VIM（B類）、OXA-48型（D類）碳青霉烯酶。第一代測序法，使用細菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA后，委托北京六合華大基因科技有限公司進行檢測。

1.3.2.3一代測序（也稱Sanger測序）法

在包括DNA模板、1條測序引物、DNA聚合酶、4種dNTP及4種ddNTP的測序反應體系中，DNA聚合酶在模板鏈的指導下，逐個將dNTP加到引物的3^′. -OH末端，使引物延伸，合成新的與模板互補的DNA鏈。在鏈的延長過程中一旦加入ddNTP，由于其雙脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基，不能同后續dNTP形成磷酸二酯鍵，鏈終止延伸。形成一系列具有相同5'-引物端和以ddNTP殘基為3端結尾的長短不一的片段混合物，通過電泳、分析從而獲得DNA的核苷酸序列，把測序結果與NCBI數據庫進行比對，得出產酶型別。引物信息參考相關文獻（表1）[8-10]。

1.3.2.4 質量控制

以大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705為質控菌株（均為實驗室保存菌株）。

2結果

2.1菌株來源及分布

本院2022年1月—2023年10月間分離的74株CRE細菌中，患者性別以男性為主，患者年齡分布為（66.4±17.3） 歲，患者科室以ICU為主，菌株標本來源主要為呼吸道標本（痰液及支氣管肺泡灌洗液）及尿液，菌株類別主要為肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌（表2）。

Tab.1 Primers used for detecting carbapenemase genes

2.274株CRE菌株對常見抗菌藥物及依拉環素敏感 情況

2.2.174株CRE對常見抗菌藥物敏感情況

74株CRE菌株均對大多數常見抗菌藥物耐藥。 對頭孢他啶/阿維巴坦、黏菌素及替加環素的敏感性 較高（表3）。

2.2.274株CRE菌株對依拉環素體外活性

表1碳青霉烯酶基因引物系列

表274株CRE的臨床分布Tab.2 Clinical distribution of74 CRE strains

注：*其他腸桿菌目細菌包括產氣克雷伯菌、陰溝/阿氏腸桿菌、神戶腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和雷氏普羅維登斯菌。

Tab.3 Resistance statusof74CRE strainstocertain antibacterials

注：*2023年CLSIM100黏菌素無敏感折點；“-”代表未定義。

MIC₅₀ 表示抗菌藥物能抑制 50% 受試菌生長所需的最低藥物濃度， MIC₉₀ 表示抗菌藥物能抑制 90% 受試菌生長所需的最低藥物濃度。依拉環素對74株CRE菌株保持了較好的活性（表4）。

表374株CRE菌株對部分抗菌藥物耐藥情況

表574株CRE菌株碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗酶型檢測結果 Tab.5Resultsof the carbapenemase inhibitor enhancement test for 74 CRE strains

注：*非敏感-美國FDA藥敏標準，依拉環素對腸桿菌目細菌無耐藥或中介折點。

2.374株CRE酶型檢測結果

2.3.1碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗

碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗檢測結果見表5。 A類酶代表A類絲氨酸碳青霉烯酶酶；B類酶代表B類 金屬β-內酰胺酶；D類酶代表D類OXA-48型絲氨酸碳 青霉烯酶。74株菌株中，肺炎克雷伯菌以產A類碳青 霉烯酶為主，大腸埃希菌以產B類金屬酶為主。

2.3.2膠體金免疫層析法及一代測序法檢測碳青霉烯酶

經檢測，膠體金免疫層析法及一代測序法檢測碳青霉烯酶兩者結果一致。74株細菌中，52株 （70.3%） 檢測出碳青霉烯酶/基因，22株 （29.7%） 為非產碳青霉烯酶/基因菌株，見表6。酶抑制劑增強試驗與膠體金免疫層析法/一代測序法相比，符合率為 93.2% 。2株肺炎克雷伯菌、1株普羅維登斯菌，膠體金免疫層析法/一代測序法檢出IMP酶，而酶抑制劑增強試驗陰性；1株肺炎克雷伯菌、1株產氣克雷伯菌，酶抑制劑增強試驗結果為同時產A類絲氨酸碳青霉烯酶及B類金屬β-內酰胺酶，而膠體金免疫層析法/一代測序法未檢出碳青霉烯酶。1株大腸埃希菌，酶抑制劑增強試驗提示為產A類絲氨酸碳青霉烯酶，而膠體金免疫層析法/一代測序法未檢出碳青霉烯酶。3種酶型檢測方法檢測結果比較見表7。52株陽性菌和22株陰性菌的耐藥表型見表8。所有產碳青霉烯酶菌株對亞胺培南、美羅培南耐藥，而碳青霉烯酶陰性菌株中分別有40.9% 和 38.1% 對上述兩種抗菌藥物敏感；氨曲南能抑制B類金屬β-內酰胺酶，故部分產B類金屬β-內酰胺酶細菌對氨曲南敏感，但如果菌株同時產B類金屬β-內酰胺酶及超廣譜β內酰胺酶，則可能因超廣譜β內酰胺酶水解氨曲南而導致菌株對其耐藥。兩類菌株對黏菌素、替加環素、依拉環素耐藥率接近。

表4依拉環素對74株CRE的藥敏分布情況 Tab.4Susceptibility distribution of eravacycline to 74 CRE strains

Tab.6Carbapenemase type test results of 74 CRE strains detected usingcolloidal gold immunochromatography and firstgeneration sequencing

表73種方法檢測酶型結果比較

表674株CRE菌株膠體金免疫層析法/第一代測序法酶型檢測結果

Tab.7 Comparison of three methods for the detecting of carbapenemase

表852株酶型檢測陽性菌株及22株酶型檢測陰性菌株藥敏結

Tab.8 Comparison of drug sensitivity results of certain antibacterialsbetween52 carbapenemase positive strainsand22 carbapenemasenegative strains

注：*非敏感-美國FDA所發布的依拉環素藥敏折點標準無耐藥折點；“-”代表未定義。

3討論

CRE感染的檢測、診治與防控，是近年微生物與感染專業的一個熱點。CRE菌株的臨床分離在全球范圍內呈上升勢，引發關注。2017年，鑒于耐藥菌對人類的巨大威脅，世界衛生組織（WHO）發布了包含6種耐藥菌（屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌目）的“ESKAPE”關鍵優先級清單[12]。研究不同地區的CRE菌株耐藥機制及其對新型抗菌藥物的耐藥情況，對本地區CRE的流行情況、治療及防控，有積極意義。

張鴻娟等[13]研究了無菌體液中CRE菌株的臨床分布，科室來源主要為急診監護室、重癥醫學科，標本來源主要為血液，菌株來源主要為肺炎克雷伯菌。本研究中的74株菌株，科室來源主要為ICU，標本來源主要為呼吸道標本、尿液。菌株分布主要為肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌。

CRE主要耐藥機制有3種：產碳青霉烯酶、外排泵及通道蛋白改變。其中產碳青霉烯酶是主要耐藥機制[7。目前臨床常用碳青霉烯酶酶型檢測方法為PCR法、膠體金免疫層析法和碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗等。PCR是檢測酶型的金標準，但較難在基層實驗室開展。膠體金免疫層析法操作簡單、容易判讀，但試劑條價格較高[7]。李虹玲等[14]對126株CRE菌株使用研究顯示，碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗結果與基因檢測結果完全一致。張鴻娟等[研究指出，使用膠體金免疫層析法檢測碳青霉烯酶，其特異度和靈敏度和分別為 97.1% 和 100% 。本研究74株CRE菌株用膠體金免疫層析法檢測碳青霉烯酶酶型結果與一代測序結果完全一致。碳青霉烯酶酶抑制劑增強試驗具有試劑價格低廉、操作簡單的特點，可以初步把菌株產酶分為A類絲氨酸碳青霉烯酶、B類金屬β-內酰胺酶、D類OXA-48型碳青霉烯酶[7]。周銀娣等[16]研究指出，酶抑制劑增強試驗結果與分子生物學檢測結果總體符合率為 87.3% ，檢測金屬β-內酰胺酶結果與分子生物學方法符合率為 100% 。本研究中，酶抑制劑增強試驗結果與膠體金免疫層析法/分子生物學檢測結果符合率為 93.2% 。本研究顯示，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗在檢測IMP金屬酶會出現假陰性結果（3/3， 100% ，與周銀娣等[16]結果不符，該試驗檢測IMP金屬酶的性能，需要進一步評估。另有3株菌株，膠體金免疫層析法/一代測序法檢測為陰性而碳青霉烯酶抑制劑增強試驗結果為陽性，出現此結果，除需考慮酶抑制劑增強試驗可能存在假陽性，還需考慮因前兩種方法只檢測5種最常見碳青霉烯酶而可能漏檢某些少見酶型，具體原因需要進一步研究確認。此結果顯示酶抑制劑增強試驗作為一個低成本且相對容易操作的試驗方法，可以作為初篩試驗，對CRE菌株產碳青霉烯酶情況作初步分型。少數CRE菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥機制為產超廣譜β-內酰胺酶和/或AmpC酶并合并膜孔蛋白下調或缺失[7]。本研究74株CRE菌株中，有22株 （29.7%） 碳青霉烯酶酶型檢測陰性，陰性率與李虹玲等[14]試驗結果相似 28.8% ，203/704），高于郭主聲等試驗結果（20.6% ，27/131）[17]。22株碳青霉烯酶酶型檢測陰性菌株對阿莫西林克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦至少1種耐藥，提示碳青霉烯酶酶型檢測陰性菌株的耐藥機制可能為上述復合耐藥機制。

從本院CRE菌株的藥敏結果來看，對頭孢他啶/阿維巴坦、黏菌素和替加環素的敏感性較高，分別為 74.0% 、 94.6% 和 98.6% 。然而頭孢他啶/阿維巴坦對產金屬 β -內酰胺酶菌株（主要為大腸埃希菌）耐藥，黏菌素臨床一般不單獨使用，而替加環素血藥濃度較低，CRE血流感染后治療困難。Wang等[18]研究指出，住院患者發生CRE血流感染，死亡率高達57.4% 。治療CRE感染亟需新抗菌藥物。依拉環素作為一種2023年在國內上市的新型抗菌藥物，評估其對多重耐藥菌的敏感情況，可以對臨床抗感染治療，提供參考。體外研究表明依拉環素對多種細菌尤其多重耐藥菌具有廣譜抗菌活性[19-20]，Zou等[21]研究表明對耐碳青霉烯革蘭陰性菌，依拉環素MIC范圍為 ?0.0625～16mg/L ，依拉環素的 MIC₅₀ 及 MIC₉₀ 比替加環素低2倍左右。本研究中顯示，依拉環素對碳青霉烯酶酶型檢測陽性及陰性CRE菌株，均具有較強活性。需要指出的是，本次依拉環素藥敏試驗采用E-test法，并非標準藥敏試驗方法（肉湯稀釋法），試驗結果可能存在一定誤差。本次依拉環素藥敏試驗結果參照美國FDA判定標準，可能跟敏感率真值有誤差。此結果提示，依拉環素可能在臨床治療CRE感染中發揮作用，實際應用價值需進一步臨床研究證實。

參考文獻

[1] Centers forDisease Control and Prevention.Facility guidance forcontrol of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae（CRE）， November 2015update[EB/OL].[2024-05-27].https：// www.cdc.gov/infection-control/media/pdfs/guidelines-creguidance-508.pdf.

[2] CHINET全國細菌耐藥監測網.CHINET數據云/細菌分類 年份統計[EB/OL].[2024-05-23].https：//www.chinets.com/ Data/GermYear.

[3] Suay-GarciaB，Perez-GraciaMT.Presentand futureof carbapenem-resistant Enterobacteriales （CRE） infections[J]. Antibiotics（Basel），2019，8（3）：122.

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].M100，33rdEdition，CLSI，2023.

[5] 中國醫療保健國際交流促進會臨床微生物與感染分會， 中華醫學會檢驗醫學分會臨床微生物學組，中華醫學會 微生物學與免疫學分會臨床微生物學組.多黏菌素類與 替加環素及頭孢他啶/阿維巴坦藥敏方法和報告專家共識 [J].中華檢驗醫學雜志，2020，43（10）：964-972.

[6] FDA.Eravacycline-Injection Products[EB/OL]. （2022-06- 06）[2024-05-27].https：//www.fda.gov/drugs/developmentresources/eravacycline-injection-products.

[7] 喻華，徐雪松，李敏，等.腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗 室檢測和臨床報告規范專家共識[J].中國感染與化療雜 志，2020，20（6）：671-680.

[8]Patrice N，Laurent P，Amelie C，et al. How to detect NDM-1 producers[J]. JClinMicrobiol，2011，49（2）：718-721.

[9]Zhang P， Shi Q， Hu H，et al. Emergence of ceftazidime/ avibactam resistance in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in China[J]. ClinMicrobiol Infect，2020，26（1）： 124.e1-124.e4.

[10] Wang X， Wang Y，Zhou Y，et al. Emergence of a novel mobile colistin resistance gene， mcr-8， in NDM-producing Klebsiella pneumoniae[J].Emerg Microbes Infect，2018，7（1）：122.

[11]Efthymia P，Georgios M，Dimitrios P， et al. Polyclonal endemicity of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in ICUs of a Greek tertiary care hospital[J]. Antibiotics （Basel），2022，11（2）：149.

[12] Giuseppe M，Angelina M，Elisabetta G，et al. Bacterial antibiotic resistance： The most critical pathogens[J]. Pathogens，2021，12（10）：1310.

[13] 張鴻娟，孟雪斐，馬志剛，等.無菌體液中耐碳青霉烯腸桿 菌科細菌的臨床分布及耐藥性分析[J].檢驗醫學與臨床， 2022，19（4）： 438-442.

[14]李虹玲，鐘一鳴，晏群，等.臨床分離碳青霉烯類耐藥腸桿菌 目細菌菌株的分子流行病學及碳青霉烯酶抑制劑增強試驗 的應用[J].中南大學學報（醫學版），2023，48（8）：1210-1216.

[15]張鴻娟，孟雪斐，宋貴波，等.膠體金免疫層析法在碳青 霉烯酶檢測中的價值及應用[J]：中國抗生素雜志，2023， 48（1）： 115-120.

[16] 周銀娣，郭燕，張琴，等.3-氨基苯硼酸聯合乙二胺四乙酸 碳青霉烯酶抑制增強試驗檢測腸桿菌目細菌產碳青霉烯 酶的研究[J].中國感染與化療雜志，2022，22（1）：65-71.

[17]郭主聲，呂飛，謝樹金.2016—2018年東莞地區耐碳青霉 烯類腸桿菌目細菌的耐藥表型、耐藥機制和分子流行病 學分析[J].中國抗生素雜志，2023，48（7）：798-805.

[18] Wang Q，Zhang Y， Yao X，et al.Risk factors and clinical outcomes forcarbapenem-resistant Enterobacteriales nosocomial infections[J].EurJ Clin Microbiol Infect Dis， 2016，35（11）： 1679-1689.

[19]Stephen H，Nimmi K，Federica M，et al.In vitro activityof eravacycline and comparators against Gram-negative and Gram-positive bacterial isolates collected from patients globally between 2017 and 2020[J]. J Glob Antimicrob Resist，2023，33：304-320.

[20] Kenneth R，Bahgat G，Lior N， etal.In vitro activity of eravacycline and comparator agents against bacterial pathogens isolated from patients with cancer[J]. JAC Antimicrob Resist，2023，5（2）： dlad020.

[21] Zou X，Jin S， Chen L，et al. Antibacterial activity of eravacyclineagainst carbapenem-resistant Gram-negative isolates in China：An in vitro study[J]. Infect DrugResist， 2023，16： 2271-2279.