積術(shù)丸調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化及PAR-2/CGRP通路治療慢傳輸型便秘脾虛證小鼠的機(jī)制研究

[關(guān)鍵詞]慢傳輸型便秘；枳術(shù)丸；肥大細(xì)胞；蛋白酶激活受體-2；降鈣素基因相關(guān)肽[中圖分類號]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.08.003

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethemechanismof Zhizhu Pillonmicewith slowtransitconstipation （STC）and spleen deficiencypattnbyregulatingmastcell（MC）activationandproteaseactivatedreceptor-2（AR-2）calcitonngen-relatedpeptide （CGRP）pathway.Methods Thirtymice wereused toestablishan STC model with splen deficiency pattm usingacombinationof senaleaf gavagerestricteddietand waterintakeandalow-fiberdietThesemice wererandomlydividedinto model group（10 m/kg sterile water gavage， n=10 ），mosapride group （2.5mg/kg mosapride solution gavage， n =10），and Zhizhu Pill group （9 g/kg Zhizhu Pill decoction gavage， n=10 ）. Ten additional mice served as the normal group （ 10mL/kg sterile water gavage）. After seven consecutive daysof intervention，bodyweightandintestinalpropulsionateofmiceweremeasured.Colonicmucosalpathologywasoseedvia HEstaining.MCmorphologicalchangeswereobservedviatransmissionelectronmicroscopyThemRNAexpresionsof tryptase， PAR-2，and CGRPinthecolonicmucosaof micewere determined viaRT-PCR.Expresions oftryptaseandPAR-2 werechecked byImmunohistochemistry（IHC）.ProteinexpressonsoftryptaseandPAR-2weremeasuredbyWesternblotCGRPcontentof serum，braintisse，andcolonicmucosawas measuredbyELISA.Results Comparedwiththenormal group，miceinthemodel groupdemonstrtedggavatedclocucosaldainfmatoryellinfilrationdologicalagesd bysignificantly increased inflammatory pathological points（ P lt;0.05），decreased body weight and intestinal propulsion rate （ P lt;0.01）， elevated protein expressions of tryptase and PAR-2 in colonic mucosa （ P lt;0.05， Plt;0.01 1）， increased mRNA expressions of tryptase， CGRP， and PAR-2 （ Plt; O.01），and increased CGRP content in serum，brain tissue，and colonic mucosa （ Plt; 0.01）.Compared with the model group，bothmosaprideandZizuPillgoupsebitedameloratedolonicucosaldemainflmmatorycellifiltratioadMC morphological changes with decreased inflammatory pathological points （ P lt;0.05），along with increased bodyweight and intestinal propulsion rate （ P lt;0.01），reduced protein expresions of tryptase and PAR-2，decreased mRNA expresions of tryptase， CGRP，and PAR-2 （ P： lt;0.05， Plt;0.01 ），and reduced CGRPcontent of serum， brain tissue，and colonic mucosa （Plt;0.01）. Compared with the mosapride group，mice in the Zhizhu Pill group showed increased body weight （ P lt;0.05） and decreased mRNA expressions of tryptase， CGRP， and PAR-2 （ P- lt;0.05， Plt;0.01 ）. Conclusion Zhizhu Pill can alleviate constipation symptoms in STC with spleen deficiency pattrn. Its mechanismmayberelatedtothesupressonofMCactivationinibitionoftryptaseandPAR-2expressiondowegulatioof CGRP secretion，and promotion of intestinal motility.

[Keywords]slowtrasitconstipation;Zhizu Pill;mastcell proteaseactivatedreceptor-2;；calcitoningene-relatedpeptide

慢傳輸型便秘（slowtransit constipation，STC）是因結(jié)腸動力不足導(dǎo)致腸道內(nèi)容物傳輸緩慢的慢性功能性便秘，以排便次數(shù)減少、費(fèi)力、糞便干結(jié)及腹脹為主要癥狀I(lǐng)。STC遷延難愈可引發(fā)心腦血管疾病、腸癌并伴隨焦慮、抑郁等問題，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量2。腸道動力由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞、腸神經(jīng)系統(tǒng)主導(dǎo)[3。“腦-腸\"軸功能失調(diào)是STC發(fā)病的關(guān)鍵[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜肥大細(xì)胞（mastcell，MC）可釋放類胰蛋白酶（Tryptase），裂解并激活腸神經(jīng)元蛋白酶激活受體-2（protease-activated receptor-2，PAR-2），促進(jìn)抑制性肽即降鈣素基因相關(guān)肽（cal-citoningenerelatedpeptide，CGRP）的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動，該過程體現(xiàn)了“腦-腸\"軸之間的交互協(xié)調(diào)[5-7]。

有研究證實(shí)，STC患者腸道炎癥反應(yīng)被激活，結(jié)腸組織內(nèi)MC浸潤數(shù)目顯著增加[8。前期研究發(fā)現(xiàn)，STC脾虛證小鼠結(jié)腸黏膜充血、腫脹，有輕度炎癥改變;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)采用李東垣《脾胃論·卷下·調(diào)理脾胃治驗(yàn)》中的經(jīng)典方劑積術(shù)丸進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)其能夠改善 STC脾虛證小鼠結(jié)腸黏膜炎癥[10-]。枳術(shù)丸方中白術(shù)為君，補(bǔ)脾益氣，枳實(shí)為臣，化積導(dǎo)滯，其補(bǔ)而不滯，消不傷正，體現(xiàn)“攻補(bǔ)兼施\"的配伍思想。臨床常用于脾虛導(dǎo)致的慢性胃炎、功能性消化不良、便秘的治療[]。臧彬如[3研究發(fā)現(xiàn)，枳術(shù)丸可通過下調(diào)CGRP表達(dá)改善胃腸動力。但枳術(shù)丸是否能通過影響MC活化及PAR-2/CGRP通路的關(guān)鍵蛋白改善結(jié)腸黏膜炎癥值得進(jìn)一步研究。故本實(shí)驗(yàn)擬采用枳術(shù)丸湯劑干預(yù)STC脾虛證模型小鼠，通過行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方面進(jìn)一步探究枳術(shù)丸治療STC脾虛證的藥效學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

40只SPF級健康KM小鼠，體質(zhì)量（ 20±2 ） g ，雌雄各半。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，溫度（ 22±2 ） C ，相對濕度 45%～55% 。本研究中所涉及的動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，編號：LLBH-202104230001。實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品、試劑與儀器

麩炒積實(shí)、生白術(shù)、番瀉葉（安徽毫藥千草中藥飲片有限公司，批號：CK21032906、NG21042703、1904050）；枸橡酸莫沙必利片（魯南貝特制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990317）。根據(jù)李東垣《脾胃論》中枳術(shù)丸的記載，枳實(shí)與白術(shù)按1：2配制，取枳實(shí)30g 、白術(shù) 60g ，加入 1500mL 蒸餾水中浸泡、煎煮過濾后蒸發(fā)濃縮成1 g/mL 的藥液;番瀉葉 250g 加入 2 500mL 沸水中密封浸泡 20min ，過濾后將濾液蒸發(fā)濃縮成 1g/mL 的藥液。兩種藥液分裝于無菌凍存管中，密封、編號，冷凍備用。

HE染液（武漢博爾夫生物科技有限公司，批號：BH0001）；電鏡固定液（武漢市皮諾飛生物科技有限公司，批號：210104）；Tryptase抗體、重組PAR-2抗體（美國Abcam公司，批號：ab2378、ab180953）；CGRPELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：027706MO）。

透射電鏡（日本日立株式會社，型號：JEM1400）；熒光定量PCR儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，型號：CFX ConnectChemidoc XRS+ ；酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：Rt-6100）。

1.3 模型制備

采用經(jīng)本課題組多年論證建立的STC脾虛證小鼠模型[4]，即：第1～7天，按 0.5mL 只每天灌胃1g/mL 番瀉葉藥液，正常飲食飲水，造成脾虛狀態(tài)；第8天起停止灌胃，隔天喂食生大米 6g/ 只、自由飲水1次，每次 30min ，連續(xù)8d;15d后，小鼠通過低纖維飲食、限食和限水以減慢腸道蠕動，造成便秘狀態(tài)。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠精神狀態(tài)較差，性情急躁易怒，外形瘦小，被毛發(fā)黃疏松、欠光澤，甚者豎毛，皮膚松軟，部分拱背、脫肛，活動減少，食納減少，造模前期大便溏稀，次數(shù)增多，后期大便逐漸成形、變硬，次數(shù)減少，顆粒變小；小鼠消化道解剖示，大便主要聚集在結(jié)腸，呈串珠狀，空腸和回腸無明顯糞便殘留，檢測小鼠腸道推進(jìn)率較正常小鼠均明顯降低[15]。

1.4 分組及給藥

將40只小鼠隨機(jī)分為正常組（10只）和造模組（30只）。造模15d后，將造模組按隨機(jī)數(shù)字表法均分為模型組、積術(shù)丸組和莫沙必利組，并每組取3只驗(yàn)證造模成功。按 60kg 成人的體表面積與臨床給藥劑量折算出小鼠每天給藥劑量[13]。枳術(shù)丸組按9.0g/（kg?d） 給藥，莫沙必利組按 2.5mg/（kg?d） 給藥，模型組和正常組給予 0.1mL/10g 蒸餾水灌胃，每天2次，持續(xù)給藥 ^7d 。枳術(shù)丸、莫沙必利實(shí)驗(yàn)用量均為臨床等效劑量。

1.5 取材

治療完成后，小鼠禁食不禁水 24h ，經(jīng)口灌人印度墨水 0.2mL 只， 20min 后眼球取血并脫頸處死，立即剖腹取出幽門至回盲部的全部腸道，生理鹽水沖洗，取近端結(jié)腸新鮮腸壁3段，分裝、保存。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1體質(zhì)量及腸道推進(jìn)率測量測量并記錄小鼠治療前后的體質(zhì)量變化。測量腸道染黑長度及腸道全長，并計(jì)算腸道推進(jìn)率。腸道推進(jìn)率 ?= 腸道染黑長度（ （cm） /腸道全長 （cm）×100% 。

1.6.2HE 染色觀察小鼠結(jié)腸黏膜病理情況取4% 多聚甲醛固定小鼠結(jié)腸組織 24h 以上，脫水包埋切片及HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸黏膜病理改變并拍照記錄。樣本以 4% 多聚甲醛進(jìn)行固定，梯度濃度乙醇脫水、包埋、切片、染色后，鏡下觀察。HE染色步驟如下。（1）脫蠟、水化： 60°C 烘箱 60min ，二甲苯 5～10min×2 次 95%.85%.75% 無水乙醇 3～5min×2 次，漂洗 2～3min 。（2）染色：蘇木素浸染，水洗； 1% 鹽酸乙醇分化，沖洗，組織呈現(xiàn)為藍(lán)色；伊紅浸染，通過顯微鏡觀察，細(xì)胞核呈現(xiàn)為藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈現(xiàn)為粉紅色。（3）脫水： 75%.85% 、95% 無水乙醇 ，3～5min×2 次。（4）透明：二甲苯 3～5min× 2次。（5）封片：中性樹膠封片。

1.6.3透射電鏡觀察小鼠結(jié)腸組織MC形態(tài)取各組無污染的近端結(jié)腸組織約 1mm³ ，立刻置于 2.5% 戊二醛中固定， 4‰ 避光保存后置入PBS緩沖液中。再放入 1% 鋨酸后固定 1～2h ，依次逐級脫水、浸泡，純環(huán)氧樹脂包埋后烘烤。取出包埋塊修塊后切取超薄切片。銅網(wǎng)撈片，電子染色（鉛、鈾染色）。用透射電鏡觀察，數(shù)碼相機(jī)記錄圖像。

1.6.4免疫組化檢測小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)用石蠟包埋小鼠結(jié)腸組織，切片脫蠟脫水，進(jìn)行抗原修復(fù)，在 3% 過氧化氫溶液中室溫避光孵育 25min 后，滴加 3%BSA 室溫封閉 30min 。滴加一抗 Tryptase（1：200）PAR-2（1：200）于濕盒內(nèi)4‰ 孵育過夜。滴加二抗Tryptase（1：500）PAR-2（1：500）室溫孵育 50minPBS 洗滌后滴加新鮮配制的DAB顯色液。蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片后，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.6.5Western blot 檢測小鼠結(jié)腸黏膜 Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)取出小鼠結(jié)腸組織樣本，依次進(jìn)行PBS緩沖液漂洗、總蛋白提取、BCA法測定蛋白濃度、總蛋白溶液變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉1h后，裝入相應(yīng)的一抗Tryptase（1：1O0O）PAR-2（1：1000）稀釋液雜交袋中4 C 孵育過夜。加入稀釋后的二抗（1：20000）與膜孵育1h，滴加新鮮配制的顯影液到膜的蛋白面?zhèn)龋@影、定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，采用AlphaEaseFC6.0軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6.6RT-PCR 檢測小鼠結(jié)腸黏膜 Tryptase、PAR2、CGRPmRNA表達(dá)取小鼠結(jié)腸組織于 700μL 的Trizol勻漿管中，依次進(jìn)行勻漿、溫育、離心后，提取組織總RNA，置于-80 C 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｏ俁NA中的DNA和DNase1，對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA的第一條鏈，置于 -20°C 保存。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物序列（見表1），完成后放入熒光定量PCR儀中并在Bio-RadCFXMan-ager軟件上設(shè)定檢測。

表1Tryptase、PAR-2、CGRP基因序列

Table1 Tryptase，PAR-2，and CGRP gene sequences

1.6.7ELISA檢測小鼠血清、腦組織、結(jié)腸黏膜CGRP含量取出小鼠眼球血清上清液、結(jié)腸、腦組織解凍后按CGRP的ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測CGRP含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性檢驗(yàn)時，采取單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法：若不滿足時，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠體質(zhì)量、腸道推進(jìn)率比較

與正常組比較，模型組體質(zhì)量及腸道推進(jìn)率降低 （Plt;0.01） 。與模型組比較，枳術(shù)丸組體質(zhì)量增加0 Plt;0.01 ;莫沙必利組和枳術(shù)丸組腸道推進(jìn)率升高（Plt;0.01 ）。與莫沙必利組比較，枳術(shù)丸組體質(zhì)量增加（Plt;0.05） 。詳見表2。

表2各組小鼠體質(zhì)量和腸道推進(jìn)率比較

Table2 Comparison of body weight and intestinal propulsion rate among different groups of mice （ ， n=6 ）

注：與正常組比較， ^**Plt;0.01 ；與模型組比較， ^##Plt;0.01 ;與莫沙必 利組比較， ^?Plt;0.05， 0

2.2各組小鼠結(jié)腸黏膜HE病理檢測結(jié)果

正常組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體豐富，排列整齊，無充血、水腫等改變，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)尚完整，腺體排列不齊，結(jié)腸黏膜可見輕微充血、水腫，可見部分炎癥細(xì)胞浸潤。莫沙必利組及枳術(shù)丸組小鼠結(jié)腸黏膜層黏膜結(jié)構(gòu)較完整，腺體豐富，排列整齊，無充血、水腫等改變，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。對結(jié)腸病理表現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證評價，與模型組相比，正常組、莫沙必利組及枳術(shù)丸組炎癥評分均下降 （Plt;0.05） 。詳見圖1。

2.3 各組小鼠結(jié)腸黏膜MC透射電鏡觀察結(jié)果

正常組小鼠結(jié)腸黏膜MC形態(tài)規(guī)則，呈圓形，胞膜完整，顆粒未脫落。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜MC形態(tài)較不規(guī)則，細(xì)胞周圍多片絮狀物，呈脫落顆粒狀。與模型組比較，莫沙必利組MC形態(tài)較規(guī)則，呈圓形，細(xì)胞周圍少片絮狀物，脫落顆粒程度不明顯；積術(shù)丸組MC形態(tài)規(guī)則，呈圓形，細(xì)胞周圍少片絮狀物，脫落顆粒程度不明顯。詳見圖2。

2.4各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、PAR-2的免疫組化結(jié)果

正常組小鼠結(jié)腸黏膜有微量淺棕色顆粒分布，提示有少量Tryptase、PAR-2陽性表達(dá)；模型組小鼠結(jié)腸黏膜呈現(xiàn)大量棕色顆粒，提示Tryptase、PAR-2陽性表達(dá)增加；莫沙必利組及枳術(shù)丸組中小鼠結(jié)腸黏膜可見部分棕色顆粒分布，提示Tryptase、PAR-2陽性表達(dá)均呈減少趨勢。詳見圖3—4。

2.5各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)水平升高（ （Plt;0.05） ）。與模型組比較，莫沙必利組、枳術(shù)丸組Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)水平降低（ Plt; 0.05，Plt;0.01 ）。詳見圖5、表3。

2.6各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、CGRP、PAR-2mRNA表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組Tryptase、CGRP、PAR-2mRNA表達(dá)水平升高 （Plt;0.01） ）。與模型組比較，莫沙必利組、枳術(shù)丸組Tryptase、CGRP、PAR-2 mRNA表達(dá)水平降低 （Plt;0.01） 。與莫沙必利組比較，枳術(shù)丸組Tryptase、CGRP、PAR-2mRNA表達(dá)水平降低（ Plt; 0.01）。詳見表4。

圖1各組小鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)和炎癥評分比較

rig.1Comparison of morphology and inflammation points incolonic mucosaamong diferent groupsof mice 注：A.各組小鼠結(jié)腸黏膜HE染色圖 ×200 ;B.各組小鼠結(jié)腸黏膜組織炎癥評分比較，與模型組比較， ^*Plt;0.05 □

圖2各組小鼠結(jié)腸黏膜MC透射電鏡圖（ ×15000^? 0

Fig.2Transmission electron microscopy images of MC in colonic mucosa in each group of mice（ ×15 000^? 0

圖3各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase免疫組化圖（ ×200 ）

Fig.3Immunohistochemistry images of tryptase in colonic mucosa in each group of mice （×200）

圖4各組小鼠結(jié)腸黏膜PAR-2免疫組化圖（ ×200 ）

Fig.4Immunohistochemistry images of PAR-2 in colonic mucosa in each group of mice （×200）

圖5各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)電泳圖 Fig.5Electrophoretogramof Tryptase and PAR-2protein expressions in colonic mucosa in each group of mice

表3各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、PAR-2蛋白表達(dá)水平比較 （2

Table 3 Comparison of protein expression levels of Tryptase and PAR-2 in colonic mucosa among different groupsof mice ）

注：與正常組比較， ^*Plt;0.05 ；與模型組比較， ^*Plt;0.05 ^##Plt;0.01 。

表4各組小鼠結(jié)腸黏膜Tryptase、CGRP、PAR-2mRNA表達(dá)水平比較（ ）

Table4 Comparison ofmRNA expression levelsof Tryptase，CGRP，and PAR-2 in colonic mucosa among different groups of mice

注：與正常組比較， ^**Plt;0.01 ；與模型組比較， ^##Plt;0.01 ；與莫沙必利組比較， □edΠPlt;0.01 。

2.7各組小鼠血清、腦組織、結(jié)腸黏膜CGRP含量比較

與正常組比較，模型組小鼠血清、腦組織、結(jié)腸黏膜CGRP含量升高 （Plt;0.01 ）。與模型組比較，莫沙必

利組和枳術(shù)丸組小鼠血清、腦組織、結(jié)腸黏膜CGRP含量降低 （Plt;0.01） 。與莫沙必利組比較，枳術(shù)丸組小鼠腦組織CGRP含量升高 （Plt;0.01 ）。詳見表5。

表5各組小鼠血清、腦組織、結(jié)腸黏膜CGRP含量比較

Table5Comparison of CGRPcontent of serum，brain tissue，and colonic mucosa among different groups of mice

注：與正常組比較， **Plt;0.01 ；與模型組比較， ^**Plt;0.01 ；與莫沙必利 組比較， □edrPlt;0.01 □

3討論

STC是臨床上常見的慢性功能性腸道疾病，歸屬于中醫(yī)學(xué)“便秘\"范疇，脾虛證是STC臨床常見證型。脾主運(yùn)化，若脾胃健運(yùn)則中焦氣機(jī)順暢，氣血津液生化有源，則大腸傳導(dǎo)有序，腑氣通暢，糟粕得排；脾胃虛弱導(dǎo)致運(yùn)化功能失常，則清陽不升，濁陰不降，食滯胃腸，糟粕難下，則排便困難、大便干結(jié)及上腹部脹滿。本實(shí)驗(yàn)所用枳術(shù)丸，方中白術(shù)用量倍于積實(shí)，白術(shù)甘溫健脾以補(bǔ)中，枳實(shí)苦辛破氣以消痞，考季東垣制方之意，以“以補(bǔ)為體，寓消于補(bǔ)\"的配伍玄機(jī)，針對脾虛失運(yùn)之候，使補(bǔ)益不滯邪、行氣不傷正，為攻補(bǔ)兼施治法之典范[7。

MC脫顆粒是腸道內(nèi)炎癥激發(fā)的先導(dǎo)，能影響腸黏膜通透性、胃腸動力以及炎癥反應(yīng)[8]。Tryptase屬于絲氨酸蛋白酶家族，是MC中含量最多的中性蛋白酶，總細(xì)胞蛋白含量高達(dá) 25% ，其儲存和表達(dá)在MC中顯示出高度的選擇性，是MC活化及顆粒脫落的重要標(biāo)志[1]。PAR2屬于G蛋白偶聯(lián)受體亞族，參與多種胃腸道疾病的發(fā)生[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STC脾虛證小鼠體質(zhì)量減輕、腸道推進(jìn)率降低，結(jié)腸黏膜呈現(xiàn)炎癥浸潤等病理特征，而枳術(shù)丸和莫沙必利藥物干預(yù)后可顯著改善上述癥狀，增強(qiáng)STC脾虛證小鼠腸道動力，起到治療便秘的作用。模型組小鼠結(jié)腸Tryptase、PAR-2蛋白和mRNA表達(dá)水平較正常組明顯升高，經(jīng)枳術(shù)丸治療后Tryptase、PAR-2表達(dá)量明顯下降，表明STC脾虛證小鼠的發(fā)病與結(jié)腸黏膜MC 活化及Tryptase、PAR-2表達(dá)水平上升有關(guān)，枳術(shù)丸能下調(diào)STC 脾虛證小鼠結(jié)腸Tryptase、PAR-2表達(dá)水平。MC活化后所產(chǎn)生的Tryptase可釋放并激活PAR-2，PAR-2可作用于鄰近的內(nèi)分泌細(xì)胞和腸神經(jīng)系統(tǒng)，釋放CGRP，參與調(diào)節(jié)胃腸動力[22-23]。CGRP是一種特殊的神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞、外周及胃腸道壁內(nèi)臟神經(jīng)叢，在消化系統(tǒng)中發(fā)揮抑制胃酸分泌和胃腸道運(yùn)動的作用，是“腦-腸\"軸中的關(guān)鍵介質(zhì)24。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清、腦組織、結(jié)腸組織CGRP含量較正常組明顯升高，經(jīng)枳術(shù)丸治療后其含量明顯下降，表明STC發(fā)病可能與CGRP表達(dá)水平上升有關(guān)，且積術(shù)丸能降低STC脾虛證小鼠體內(nèi)CGRP表達(dá)量，與臧彬如等的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，枳術(shù)丸可以通過抑制MC脫顆粒，減少結(jié)腸黏膜中Tryptase釋放，抑制PAR-2的激活，下調(diào)CGRP在中樞及外周的表達(dá)，促進(jìn)腸道蠕動，緩解STC脾虛證小鼠便秘癥狀。研究初步證實(shí)，枳術(shù)丸改善炎癥治療STC脾虛證可能與其調(diào)節(jié)MC活化-PAR-2-CGRP環(huán)路并調(diào)控“腦-腸\"軸有關(guān)，為闡明STC的發(fā)病機(jī)制及積術(shù)丸治療STC脾虛證的藥效機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從方證結(jié)合角度為開展中醫(yī)經(jīng)典方的現(xiàn)代研究提供了新思路和新方法。

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（本文編輯 周 旦）