基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討天麻健腦方調(diào)控GPER/EGFR信號軸改善缺血性腦卒中的作用機(jī)制

[關(guān)鍵詞]缺血性腦卒中；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；天麻健腦方；雌激素信號通路；環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A中圖分類號R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.08.007

Mechanism of action of Tianma Jiannao Formula in ischemic stroke rehabilitation by regulating the GPER/EGFR signaling axis based on network pharmacology and cell experiments

WU Xiaoling'，NING Weimin'，LI Wenzhao2，GUO Xuan2，LIU Fasheng'，ZHAO Zhan ^I* （204 1.DongguanHospital，Guangzhou UniversityofhineseMedicine，DongguanGuangdong523O，China;2.hestClinical Medical Colege， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 51O405， China

[Abstract]Objective To investigate the mechanismof Tianma Jiannao Formula （TMJNF）in treating ischemic stroke （S）and toscreenitsactivecomponents.Methods The active componentsandtargetsof TMJNFwereobtainedfromthe TCMSPdatabase， whileIS-relatedtargetswereretrievedfromGeneCards，DisGeNET，andOMIM.TheintersectiontargetsofTMJNFandISwere obtainedfromtheVennyonlineplatform，andtheprotein-proteininteraction（PPInetworkdiagramwasobtainedfromtheSTING database andCytoscape 3.7.The DAVIDdatabase wasused forGeneOntology （GO）analysis and Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes （KEGG）pathwayenrichment analysisofthescreenedtargets，andthetop1O targetgeneswerecalculatedusing the Cytohub pluginTheregulatoryefectsofTMJNFontheGprotein-coupledestrogenreceptor（GPER）/epidermalgrowthfactor receptor （EGFRycyclicadenosine monophosphate （cAMPyprotein kinaseA（PKA）signaling pathway inhippocampal neuronalHT22 cells wereverifiedbyELISA，RT-qPCR，andWesternblotResultsThecorecomponentsofTMJNF，includingbaicaleinuecetin tetrahydroplatyhylineanlyctonkeyargetssuchasmatrixmetalloproteinase9（M-9），umorprotenp53（53）dpoten kinaseB（AKT1）.Thesecomponentswereinvolvedinbiologicalprocesessuchasresponsetoexogenousstimulihypoxiaand lipopolysaccaride，andgatedsignaingpathwaysicludinghypoxia-induciblefactor-1（HF-1），phosphatidylnositol-inse proteinkinaseB （PI3K-Akt），thyroidhormone，andestrogen.Cellarexperimentsconfirmedthat TMJNFcanpromotethe proliferation of HT22 cells damaged by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） （ P： lt;0.05or Plt;0.01 ）， reduce the expression levels of IS marker factors matrix metalloproteinase 9 （MMP-9） and C-reactive protein （CRP） （ Plt;0.05 or Plt;0.01 1）， and upregulate the protein expressions related to the GPER/EGFR/cAMP/PKA signaling pathway （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）. After treatment with estrogen receptor inhibitorsG15andICI182780，theeffectof TMJNFon HT22cellswassuppressedtovarying degrees.Conclusion TMJNFmay treat IS by activating the GPER receptor and mediating the non-genomic effects of estrogen.

[Keywords]ischemicstroke;network pharmacology; Tianma Jiannao Formula; estrogen signalingpathway;cAMP/PKA

腦卒中是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的第三大因素，也是導(dǎo)致殘疾和認(rèn)知障礙的主要原因[1。目前，腦卒中的發(fā)病率仍在不斷增加，腦卒中包括缺血性腦卒中（ischemicstroke，IS）和出血性腦卒中兩種類型，其中絕大多數(shù)患者為IS。自前，IS主要采用靜脈溶栓治療和介入治療，但靜脈溶栓治療不僅受到時(shí)間窗和適應(yīng)證的限制，且大多數(shù)患者治療后仍會(huì)出現(xiàn)不同程度的殘疾。IS中會(huì)導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)元損傷和腦損傷，而神經(jīng)元丟失是腦損傷的主要病理標(biāo)志。神經(jīng)元保護(hù)以及損傷后神經(jīng)元再生在減少卒中后腦損傷和大腦功能修復(fù)中至關(guān)重要4。目前，神經(jīng)保護(hù)類藥物的種類較少，價(jià)格高昂，且相關(guān)研究表明其在臨床應(yīng)用中療效并不顯著。抗血小板藥物（如阿司匹林、氯吡格雷）和抗凝藥物（如華法林、新型口服抗凝藥）常用于IS的一級、二級預(yù)防，以降低血栓復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。然而，抗血小板藥物存在個(gè)體差異，部分患者會(huì)出現(xiàn)阿司匹林抵抗或氯吡格雷抵抗現(xiàn)象?？鼓幬飫t需嚴(yán)格監(jiān)測凝血指標(biāo)，且存在出血風(fēng)險(xiǎn)，劑量調(diào)整困難，增加了臨床應(yīng)用的復(fù)雜性。

目前，中醫(yī)各家多認(rèn)為IS的病機(jī)是“陰陽失調(diào)，氣血逆亂，腦絡(luò)瘀阻”，這與西醫(yī)IS發(fā)病時(shí)腦部微血管阻塞的理念不謀而合-。在實(shí)際IS病例觀察中，患者常出現(xiàn)頭暈、四肢麻木、關(guān)節(jié)酸痛、喉中痰鳴、形體肥胖、舌苔白膩、脈弦等臨床表現(xiàn)，從中醫(yī)辨證的角度多為氣虛夾痰濕。半夏白術(shù)天麻湯具有化痰息風(fēng)、健脾祛濕的功效，多用于治療風(fēng)痰上擾所致頭痛、眩暈等疾病。近年來，有國內(nèi)研究者對半夏白術(shù)天麻湯治療IS的藥效學(xué)進(jìn)行臨床研究，展現(xiàn)出顯著療效[12-14]

天麻健腦方是以《醫(yī)學(xué)心悟》中“半夏白術(shù)天麻湯\"為基礎(chǔ)，結(jié)合東莞市中醫(yī)院多年臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成的名老中醫(yī)驗(yàn)方。僅2013—2018五年間，此方于東莞市中醫(yī)院共驗(yàn)證病例7000余例，在治療風(fēng)痰上擾型眩暈中體現(xiàn)突出效果。國內(nèi)研究者有進(jìn)行半夏白術(shù)天麻湯治療風(fēng)痰型IS的藥效學(xué)臨床觀察研究，均展現(xiàn)出顯著療效[12-I7]。但目前對于天麻健腦方全方的系統(tǒng)性藥理藥效研究暫無報(bào)道，相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)也尚不清晰，使得該方臨床用藥、二次開發(fā)中減方優(yōu)方、質(zhì)量控制等關(guān)鍵步驟缺失重要理論基礎(chǔ)，難以建立統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以獲得穩(wěn)定的藥效，以致其在臨床上的應(yīng)用和推廣受到制約。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建\"藥物活性成分-靶點(diǎn)-通路\"網(wǎng)絡(luò)，分析關(guān)鍵靶點(diǎn)、重要信號通路和活性成分，篩選主要活性成分和信號通路，構(gòu)建小鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪（oxygen-glucosedeprivation，OGD）模型，運(yùn)用ELISA檢測療效指標(biāo)，Westernblot、RT-qPCR驗(yàn)證通路，以探究天麻健腦方作用機(jī)制和藥效物質(zhì)，為臨床精準(zhǔn)用藥提供證據(jù)。

1材料

1.1 細(xì)胞來源

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22購自合肥萬物生物科技有限公司（生產(chǎn)批號：202108）。

1.2 試劑與藥物

MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（貨號：C0009S）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）ELISA試劑盒（貨號：PC186）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos-phate，cAMP）抗體（貨號：ab76238）Anti-表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（貨號：ab52894）、Anti-G-protein coupled recep-tor30抗體（貨號：ab260033）、Anti-CREB（環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白，phospho S133）抗體（貨號：ab32096）Anti-betaITubulin（β微管蛋白）抗體（貨號：ab179511）ERα和ERβ抑制劑ICI182780（貨號：ab120131）購自Abcam公司；蛋白酶A（proteinkinaseA，PKA）alphaAntibody（貨號：PA5-17626）購自賽默飛世爾科技有限公司；G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（Gprotein-coupled estrogen receptor，GPER）抑制劑G15（貨號：TargetMol-T7389）購自美國Cayman公司;MMP-9ELISA試劑盒（貨號： CSB-E08007m 購自武漢華美生物工程有限公司；尼莫地平（貨號：SN8560）購自北京索萊寶科技有限公司。

2方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

2.1.1獲取藥物相關(guān)靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中，通過設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ?30% 、類藥性（druglikeness，DL） ?0.18 、血腦屏障透過率（blood-brainbarrier，BBB） ?-0.3 的條件，分別查詢澤瀉、天麻、石菖蒲、茯苓、半夏、白術(shù)、鉤藤，以探尋這些中藥的活性成分及相應(yīng)的靶點(diǎn)；由于TCMSP數(shù)據(jù)庫沒有紅景天的活性成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)信息，因此，在TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）數(shù)據(jù)庫獲取紅景天的活性成分信息，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集符合設(shè)定條件的紅景天活性成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)，整合所有中藥靶點(diǎn)信息后，在UniProt數(shù)據(jù)庫（https：/www.uniprot.org/）中將靶點(diǎn)蛋白名稱替換為基因名稱。

2.1.2獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn) 通過在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中使用“ischemicstroke\"作為檢索詞，得到相關(guān)靶點(diǎn)然后合并刪除重復(fù)值。

2.1.3獲取疾病與藥物交集靶點(diǎn)將疾病和藥物成分靶點(diǎn)上傳到Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線平臺(tái)，生成韋恩圖并獲取交集靶點(diǎn)。2.1.4網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龌钚猿煞肿饔冒悬c(diǎn)創(chuàng)建適用于Cytoscape3.7版本軟件的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建所需的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)文件，將天麻健腦方的活性成分與IS的靶基因信息，連同所準(zhǔn)備的工作文件，一并導(dǎo)入至Cy-toscape3.7軟件中。采用\"CytoNCA\"插件中的De-gree指令執(zhí)行拓?fù)浞治觯⒁罁?jù)此結(jié)果進(jìn)行排序。2.1.5蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein in-teraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將天麻健腦方與IS相關(guān)基因的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），選擇“HomoSapiens\"進(jìn)行篩選，隱藏?zé)o關(guān)靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.7軟件對導(dǎo)出的tsv文件進(jìn)行可視化處理，生成PPI網(wǎng)絡(luò)圖。2.1.6GO功能和KEGG富集分析為系統(tǒng)解析交集靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及通路機(jī)制，本研究采用DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.nifcrf.gov/），對靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能注釋富集分析和KEGG通路富集分析。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1含藥血清制備天麻健腦方組成：法半夏、白術(shù)、天麻、鉤藤、澤瀉、石菖蒲各 14g ，紅景天 g_g ，茯苓 23g 。加入12倍體積的水煎煮2次（武火煮沸、文火慢煎），每次 ¹h ，濾過，合并濾液，分別濃縮至含生藥 0.366，0.442，0.504g/mL 的天麻健腦方低、中、高劑量組，給藥劑量按照小鼠與人體間的等效劑量換算[I8]。天麻健腦方低、中、高劑量組小鼠灌胃天麻健腦方藥液，對照組及模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。末次給藥 后，腹主動(dòng)脈取血，放入 4‰ 冰箱 5h 后取出， ，3 000r/min （離心半徑 15cm 離心 5min ，收集上清液。將同組的上清液混合， 56^qC 水浴滅活 30min，0.22μm 濾膜過濾，最后放入冰箱 -80°C 保存。

2.2.2細(xì)胞培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞被置于含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在 37°C 且含有

5%CO₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天傳代2.2.3OGD/復(fù)氧（reoxygenation/R）模型建立 HT22細(xì)胞正常培養(yǎng)傳代后棄去正常培養(yǎng)基，改用無糖無血清DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于充滿 95%N₂ 和 5%CO₂ 的厭氧袋中孵育 8h 。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，HT22細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞體變小，突起縮短、變細(xì)，部分細(xì)胞變圓，確定OGD/R模型建立。

2.2.4實(shí)驗(yàn)分組收集對數(shù)增長期的 HT22細(xì)胞，以 5×10⁴ 個(gè)孔接種于6孔板。將細(xì)胞分為對照組、模型組（OGD/R）天麻健腦方低劑量組（ OGD/R+ 低劑量含藥血清）天麻健腦方中劑量組（ 0GD/R+ 中劑量含藥血清）天麻健腦方高劑量組（ 0GD/R+ 高劑量含藥血清）陽性對照組（ OGD/R+ 尼莫地平）、膜受體組 （OGD/R+0.504g/mL 含藥血清+GPER抑制劑G15）、核受體組 （OGD/R+0.504g/mL 含藥血清 + 雌激素核受體抑制劑ICI182780）。對照組為DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞;模型組是OGD后往各孔加入 2mL DMEM無糖培養(yǎng)基;含藥血清組是OGD后往各孔加入用DMEM無糖培養(yǎng)基稀釋的含藥血清；膜受體組是OGD后往各孔加入用DMEM無糖培養(yǎng)基稀釋的含藥血清和 G15（10μmol?L^-1） ；核受體組是OGD后往各孔加入用DMEM無糖培養(yǎng)基稀釋的含藥血清和 ICI182780（1μmol?L^-1） ；陽性對照組給予尼莫地平 （10μmol?L^-1 ）。各組細(xì)胞給予相應(yīng)干預(yù)后，在 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 。2.2.5MTT測定細(xì)胞活力各組細(xì)胞給予相應(yīng)干預(yù)后，在3 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 。分別給每組每孔加入 10μL 配制好的MTT溶液， ⁴h 后小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入 100μL 二甲基亞砜，輕輕震蕩培養(yǎng)板 10min ，直至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，使用酶標(biāo)儀在 490nm 處測定吸光度A，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2.6 ELISA 檢測 MMP-9 和CRP因子水平各處理組完成后，根據(jù)ELISA試劑盒的操作步驟檢測各組MMP-9和CRP濃度。

2.2.7Western blot 檢測細(xì)胞中GPER、EGFRcAMP、PKA ?^p -CREB _.β -Tubulin的蛋白表達(dá)水平海馬神經(jīng)元細(xì)胞分組處理結(jié)束后，棄上清液，加入RIPA裂解液 100μL ，冰上充分裂解，4 C 下 低溫高速離心 30min 后取上清液。根據(jù)BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)測定的蛋白濃度計(jì)算出每組標(biāo)本的上樣量，將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品等體積加人樣品孔中，SDS-PACE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉 30min ，分別孵育一抗：GPER（1：1 00O）、EGFR（1：1 00O）、cAMP（1：20 000）、PKA（1：1000） ?p -CREB（1：5 000）β-Tubulin（1：1000），冰上孵育 ^12h 后 TBST洗膜，二抗（1：1000）室溫孵育1h后TBST洗膜，后滴加ECL顯影并采集圖像，以 β -Tubulin為內(nèi)參，用Im-ageJ分析各組灰度值。

2.2.8RT-qPCR 檢測細(xì)胞中GPER、EGFR、cAMP、PKA ?p? -CREB、 . -Tubulin的mRNA表達(dá)水平HT22細(xì)胞分組處理結(jié)束后，使用TRIzol試劑提取總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。反應(yīng)條件設(shè)定如下：95 C 預(yù)變性 10min ;95℃退火 10s 60^qC 下退火20s，72 C 延伸 35s_o 引物序列見表1。

表1引物序列 Table1Primer sequences

3結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.1.1天麻健腦方活性成分、靶點(diǎn)及IS靶點(diǎn)的篩選在數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果中，識(shí)別到了天麻健腦方的55種活性成分。經(jīng)過整理并去除重復(fù)項(xiàng)后，這些成分所對應(yīng)的作用靶點(diǎn)總計(jì)達(dá)到了244個(gè)，相關(guān)疾病靶點(diǎn)1584個(gè)。將藥物活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析得到95個(gè)共同靶點(diǎn)，為天麻健腦方防治IS的潛在靶點(diǎn)。詳見圖1。

圖1天麻健腦方有效成分-缺血性腦中風(fēng)疾病基因韋恩圖

3.1.2 天麻健腦方抗IS\"藥物-活性成分-靶點(diǎn)\"網(wǎng)絡(luò)圖 網(wǎng)絡(luò)圖包含了157個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有55個(gè)活性成分、95個(gè)靶點(diǎn)（涉及7味藥物），共468條相互作用的線。利用Cytoscape3.7軟件進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)“degree”值由大到小排列，獲得前十的活性成分信息。詳見圖2和表2。

3.1.3天麻健腦方活性成分抗ISPPI網(wǎng)絡(luò)分析利用Cytohub插件根據(jù)MMC值計(jì)算前六位靶基因，獲得靶基因?yàn)?MMP-9、腫瘤蛋白53（tumor protein p53，TP53）蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt1）、調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1A（hypoxia-inducible factor-1A，注;Degree越高節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深、字體大小越大，預(yù)示著該靶點(diǎn)所涉及的生物學(xué)功能更為廣泛，更具重要性。

表2度值排名前十的化學(xué)成分信息

Table 2 Top 1O chemical components ranked by degree value

圖2藥物-成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

Fig.2Drug-component-target interaction network diagram

HIF-1A）轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforminggrowth fac-torbeta-1，TGF- _?β1 ）過氧化物酶體增殖物激活受體 γ （Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR- ?γ ）。詳見圖3。

3.1.4GO 和KEGG富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析后，發(fā)現(xiàn)共計(jì)595個(gè)GO富集項(xiàng)，其中包括生物過程405個(gè)、分子功能113個(gè)和細(xì)胞組成 77個(gè)。分別從生物過程（biologicalprocess，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）分子功能（molec-ularfunction，MF）中篩選最顯著的10個(gè)過程制作GO功能分析圖（圖4），此外，KEGG富集通路共30條，結(jié)果展示排名前20的通路（圖5）。GO分析結(jié)果顯示對外源性刺激的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)等在BP中富集度較高;膜筏、細(xì)胞質(zhì)膜、神經(jīng)元細(xì)胞體等在CC中富集度較高；酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、肽酶活性等在MF中富集度較高。KEGG富集分析顯示，雌激素信號通路富集基因數(shù)目較多，排名靠前，富集顯著性較高，前十的關(guān)鍵靶蛋白有5個(gè)富集在該通路上，包括肉瘤病毒蛋白（sarcomavirusprotein，SRC）B 淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（B-cell lym-phoma 2，BCL-2） AKT1、雌激素受體α（estrogen receptoralpha，ESR1）MMP-9，均為該通路上的關(guān)鍵靶蛋白。詳見圖4。

3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1天麻健腦方含藥血清對OGD/R后HT22細(xì)胞活力的影響與對照組比較，模型組HT22細(xì)胞存活率顯著下降 （Plt;0.01） ；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組HT22細(xì)胞存活率顯著升高（ Plt; 0.01）。與低劑量組比較，中劑量組HT22細(xì)胞存活率顯著升高 Plt;0.05 ）;與中劑量組比較，高劑量組細(xì)胞存活率升高 （Plt;0.01） ，即當(dāng)給藥濃度達(dá)到 0.504g/mL 時(shí)含藥血清的抑制作用最強(qiáng)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.504g/mL 的含藥血清作用HT22細(xì)胞。詳見圖5。3.2.2天麻健腦方對各組HT22細(xì)胞中MMP-9和CRP因子水平的影響與對照組比較，模型組MMP-9和CRP的因子表達(dá)水平顯著升高（ Plt;0.05 或 Plt; 0.01）;與模型組比較，天麻健腦方組和陽性對照組MMP-9和CRP的因子表達(dá)水平顯著降低（ （Plt;0.01） 。

圖3天麻健腦方抗IS潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

Fig.3PPI network of potential targets for TMJNF against IS 注：網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)顏色越深、圖形越大表明在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

圖4天麻健腦方抗IS潛在靶點(diǎn)GO功能（A）及KEGG通路富集（B）分析柱狀 Fig.4Bar chart analysis of GO functions （A） and KEGG pathway enrichment （B） for potential targets of TMJNF against IS

詳見圖6。

3.2.3天麻健腦方對各組HT22細(xì)胞GPER/EGFR/cAMP/PKA信號通路蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，天麻健腦方組HT22細(xì)胞中GPER、EGFR、cAMP、PKA以及 p? -CREB蛋白表達(dá)升高 （Plt;0.01） ，膜受體組和核受體組GPER、cAMP、PKA以及 p -CREB的表達(dá)均下降（ Plt;0.01? ；與模型組比較，天麻健腦方組的GPER、EGFR ??cAMP 、PKA ?p -CREB蛋白表達(dá)升高 Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），核受體組和膜受體組GPER、cAMP、PKA、p-CREB蛋白表達(dá)均升高（ （Plt;0.01） ；與核受體組比較，膜受體組的蛋白表達(dá)均顯著降低（Plt;0.01） 。詳見圖7。

3.2.4 天麻健腦方對各組HT22細(xì)胞中GPER、EGFR、cAMP、PKAmRNA表達(dá)水平的影響 與對注：與對照組比較， ^##Plt;0.01 ;與模型組比較， ^**Plt;0.01 ;與高劑量組比較， ^ΦΦPlt;0.01 ；與低劑量組比較， ^ΔPlt;0.05 。

圖5不同濃度含藥血清對HT22細(xì)胞活力的影響

Fig.5Effects of different concentrations of drug-containing serum on HT22 cells

照組比較，模型組HT22細(xì)胞的GPER、EGFR 、cAMP 、PKA ?p -CREBmRNA表達(dá)水平均降低 （Plt;0.01） ；與模型組比較，天麻健腦方組和核受體組GPER、EGFR、cAMP、PKA ?p -CREBmRNA表達(dá)水平均升高（ Plt; 0.01）；與天麻健腦方組比較，膜受體組和核受體組GPER、EGFR、cAMP、PKA ?p -CREBmRNA表達(dá)水平均降低 （Plt;0.01） ；與膜受體組比較，核受體組GPER、EGFR、cAMP、PKA ?p -CREBmRNA表達(dá)水平均降低 （Plt;0.01） 。詳見圖8。

圖6ELISA檢測天麻健腦方對OGD模型HT22細(xì)胞MMP-9和CRP的影響 Fig.6Effects of TMJNFon MMP-9 and CRP in OGD-modeled HT22 cells examined by ELISA 注：與對照組比較，"^##Plt;0.01 ，"^#Plt;0.05 ；與模型組比較，"^**Plt;0.01 。

4討論

IS容易誘發(fā)腦梗死，同時(shí)伴有腦組織壞死和局灶性神經(jīng)元損傷，有較高的致死致殘風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，確定可逆的風(fēng)險(xiǎn)因素、可靠的生物標(biāo)志物、急性期管理的治療目標(biāo)以及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的干預(yù)措注：與對照組比較， ^##Plt;0.01 ；與模型組比較， ^*Plt;0.05，^**Plt;0.01 ；與天麻健腦方組比較， ^???Plt;0.01 ；與膜受體組比較， ～Plt;0.01 ○

圖7Westernblot檢測各組HT22細(xì)胞GPER/cAMP/PKA通路中蛋白的表達(dá)水平 Fig.7Protein expresson levels in the GPER/cAMP/PKA pathway of HT22 cells of each group checked by Western blot

圖8qPCR檢測各組HT22細(xì)胞中GPER、EGFR、cAMP、PKA的mRNA表達(dá)水平

Fig.8mRNA expression levelsofGPER，EGFR，cAMP， and PKA in HT22 cells of each group checked by qPCR

天麻健腦方由法半夏、天麻、白術(shù)、茯苓、澤瀉、石菖蒲、鉤藤、紅景天8味中藥組成。君藥法半夏燥濕化痰、降逆止嘔，天麻息風(fēng)止痙、平抑肝陽；臣藥白術(shù)、茯苓，健脾祛濕、濕去痰消；佐以澤瀉利下焦，石菖蒲開上焦，配合鉤藤加強(qiáng)平肝息風(fēng)之功；并以活血化瘀通絡(luò)之紅景天為佐藥，從痰濕論治IS，具有化痰祛濕，祛風(fēng)通絡(luò)的功效。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析天麻健腦方治療IS的關(guān)鍵靶點(diǎn)、重要信號通路和活性成分。通過Cytoscape的hubba插件分析，發(fā)現(xiàn)山柰酚、β-谷甾醇、黃芩苷、毛鉤藤堿、四氫鴨腳木堿等成分可能在天麻健腦方治療IS中發(fā)揮重要作用，這些成分來源于紅景天、半夏和鉤藤。相關(guān)研究表明，山柰酚可以通過抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制在阿爾茨海默病、IS等神經(jīng)退行性疾病起到神經(jīng)保護(hù)作用[22-24]。四氫鴨腳木堿可以提高OGD/R誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活力，通過Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑調(diào)節(jié)自噬25]。此外，對于毛鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿等活性成分治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有一定的研究進(jìn)展。相關(guān)研究表明，這些活性成分涉及Janus激酶1（Januskinase1，JAK1）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphat-idylinositol3-kinase，PI3K）/Akt、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nu-cleartranscription factor-kB，NF- σ_κB ）核因子E2相關(guān)因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/溶質(zhì)載體家族7成員（solutecarrierfamily 7member11，SLC7A11）/谷胱甘肽過氧化物酶4（glu-tathioneperoxidase 4，GPX4）等多條信號通路[23，24，26]，均與IS病理進(jìn)程中的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡調(diào)控密切相關(guān)，提示天麻健腦方可能通過多通路協(xié)同作用干預(yù)IS病理發(fā)展。通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，得到天麻健腦方治療IS的潛在靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)主要富集在HIF-1、PI3K-Akt、甲狀腺、雌激素等信號通路中。其中，雌激素信號通路可以通過其核受體ERα、ERβ和膜受體GPER介導(dǎo)基因組效應(yīng)和非基因組效應(yīng)，激活下游的PI3K/Akt/mTOR、cAMP/PKA、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein ki-nase，MAPK）等多條信號通路，在IS中起到神經(jīng)保護(hù)作用。核受體主要介導(dǎo)的基因組效應(yīng)起效較慢，而膜受體GPER可以啟動(dòng)并轉(zhuǎn)錄調(diào)控EGFR/cAMP/PKA快速信號通路[28。如果IS后，該通路被激活，有望可以快速發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，降低腦組織損傷和局灶神經(jīng)元的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究首先研究了天麻健腦方對OGD/R模型下HT22細(xì)胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻健腦方含藥血清可以顯著提高HT22細(xì)胞的存活率，同時(shí)這種作用可以被G15和ICI182780抑制，GPER抑制劑G15的抑制效果更加顯著。實(shí)驗(yàn)研究表明，激活GPER可減少谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元過度自噬，對染料木素抗脂多糖（genistein against lipopolysaccha-ride，Gen-LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥起到抗炎作用[29-30]，該抗炎作用可被G15所阻斷。為了研究天麻健腦方對雌激素信號通路的影響，運(yùn)用Westernblot和RT-qPCR檢測了天麻健腦方含藥血清給藥后EGFR/cAMP/PKA通路的變化情況，發(fā)現(xiàn)天麻健腦方通過上調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，且該通路主要由GPER介導(dǎo)的雌激素快速信號通路調(diào)控。MMP-9是炎癥反應(yīng)的調(diào)控因子，可通過興奮性毒性、氧化應(yīng)激等直接誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷3。CRP是重要的炎癥標(biāo)志物，可與補(bǔ)體C3結(jié)合形成膜攻擊復(fù)合體，促進(jìn)神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生，參與血腦屏障破壞。天麻健腦方對IS的標(biāo)志蛋白MMP-9和CRP同樣具有抑制作用，這種作用受到雌激素核受體和膜受體的影響。GPER抑制劑G15較核受體抑制劑ICI182780對該抑制作用的阻斷作用更加顯著。

綜上所述，天麻健腦方可以通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療IS。雌激素膜受體GPER所介導(dǎo)的快速非基因組效應(yīng)是天麻健腦方的主要作用途徑。本研究為天麻健腦方二次開發(fā)、減方優(yōu)方、質(zhì)量控制提供了理論基礎(chǔ)。

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