基于PI3K/Akt信號通路探究推法對骨骼肌過勞性損傷大鼠的修復機制

[關鍵詞]骨骼肌過勞性損傷；推拿推法；扶他林;PI3K/Akt信號通路；炎癥反應 [中圖分類號]R244.1 [文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.08.011

Mechanism of tuina on repairing skeletal muscle overuse injury in rats via PI3K/Akt signaling pathway

MU Panpan， CHEN Yimin， DUAN Miaomiao， HUANG Bo，RUAN Lei， PENG Liang* School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

[Abstract]Objective To investigate the mechanism of actionoftuina manipulation inrepairing skeletal muscleoveruse injuryinratsviathePI3K/Aktsignaling pathway.MethodsThirty-twomaleSDratswererandomlydividedintoablankgroup（8 rats）anda modeling group（24rats）usingarandom number table.Ratsinthe modeling groupunderwent4 weksof downhil running-inducedeccentriccontractionexercise toestablishskeletal muscleoveruseinjurymodels.Succesfullymodeledratswere thenrandomlysubdivided intoamodel group，atuina group，anda drug group，with8ratsineach group.At24 hours postmodeling，allgroupsofratsweresubjectedtoeadandfacial wappingwithblackcotonclothandtreatedwithmedicalvaseline application.Thetuinagroupwastreatedusingaself-madeexperimentalanimal presing manipulationapparatus，whilethedrug group received Voltaren （ 1% diclofenac diethylamine emulgel） twice daily for 3 consecutive days.Beforeand after the intervention， behavioralaessmentoftheratswasconductedusingthebalancebeamtestAftertheintervention，HEstainingwasusedto observemorphologicalchangesingastrocnemiusmuscleissue，ELISAwasusedtoquantifyplasmalevelsoftumrnecrosisfactor α （20 （TNF-α），interleukin-1β（IL-β）andinterleukin-8（IL-8）andWesternblotwasusedtodetermineproteinexpreof phosphatidylosiol3iase （K）proteinaseB（kt）dosportedkt（-Akt）iastrostueReults with pre-treatmentvalues，boththe tuinaanddrug groups showedsignificantlyshortenedbalancebeam walkingtimeandreduced paw slips post-treatment （ P αα_αα_αα_αα_αα_αα_βα_αα_βα_βα_βα_βα_βα_βα_βα_βα_β IL- ?1β ，and IL-8 （ Plt;0.01 ），aswell as elevated protein expressions of PI3K，Akt， and p -Akt （ P lt;0.01）. Compared withthemodel group，boththetuinaanddrug groups hadshortened beam walkingtime andreduced paw slips （P0.01）， decreased inflammatory cell infiltration in the gastrocnemius muscle，and reduced contents of IL- 1β and IL-8（ P lt;0.05， P?0.01 1）.The tuina group showed increased protein expressions of PI3K and Akt （ P lt;0.05， P?0.01 ），while the drug group had increased protein expressions of PI3K，Akt， and p-Akt （ P lt;0.05， Plt;0.0 1）.Compared with the tuina group，the drug group had increased IL-8 content L P lt;0.05）.ConclusionTuinamanipulationcanamelioratechronicoveruse-inducedskeletalmuscleinjury.Itsmechanismofaction mayinvolveactivationof thePI3K/Aktsignalingpathwayandmodulationofrelevantinflammatoryfactorsandproteinexpressionsof PI3K，Akt，andp-kt，ebyimpringseletalmuscleaitecure，suppesingoiciationandromoguscle repair.

[Keywords]skeletal muscleoveruseinjury;tuinamanipulation;Voltaren；PI3K/Aktsignalingpathway；inflammatoryresponse

骨骼肌過勞性損傷又稱運動性肌肉勞損或慢性肌肉損傷，是由于長期重復性機械負荷超過肌肉適應能力而導致的漸進性病理改變，常見于運動員、體力勞動者及健身人群，在運動損傷中占 10%～55%^[1] 。其典型癥狀表現為局部疼痛、肌肉僵硬、力量下降及運動功能障礙，如不及時治療將嚴重影響患者的生活質量。骨骼肌損傷后會經歷3個關鍵階段，分別是急性炎癥反應初期、肌衛星細胞的活化與增殖再生階段、再生纖維的成熟與重塑期2。在肌肉損傷后的修復過程中，炎癥反應的持續性與嚴重性不僅對肌衛星細胞的正常功能及肌肉的再生潛力造成阻礙，還常常誘發組織內血腫和修復性纖維化瘢痕形成。這種病理狀態嚴重削弱骨骼肌的收縮效能，使骨骼肌的形態和功能恢復緩慢，肌肉再次受傷的風險增加。研究發現，慢性骨骼肌損傷發生后，易導致肌肉痙攣、萎縮以及凝血功能異常，這些癥狀可進一步誘發炎癥反應3。肌肉的再生過程與損傷后的炎癥反應緊密相連4。因此，應重點研究骨骼肌損傷與修復過程的炎癥變化。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidy-linositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase，PKB，Akt）構成的信號通路是骨骼肌損傷修復的重要途徑之一。降低炎癥反應的程度，對肌肉組織損傷后的恢復具有積極影響。因此，調控PI3K/Akt信號通路以及控制炎癥反應，是促進骨骼肌損傷修復的有效途徑之一。近年來，推法廣泛應用于傷科疾病，在疼痛的局部施用推法，起到舒筋、理筋、整復的作用，達到行氣活血、疏經通絡的目的。本研究通過構建骨骼肌過勞性損傷大鼠模型，觀察PI3K/Akt信號通路相關蛋白水平和炎癥因子的變化，探討推法對骨骼肌過勞性損傷的修復效果及效應機制。扶他林具有顯著的抗炎、鎮痛作用，常用于治療急慢性肌肉損傷，故本實驗選用扶他林作為藥物對照。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級健康成年雄性SD大鼠32只，7～8周齡，體質量 220～250g ，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-2009。所有實驗大鼠均遵循標準化的飼養流程，飼養環境溫度 20～ 25^°C ，濕度 50%～70% ，自由進食進水， 12h/12h 明暗循環。本研究嚴格遵守倫理準則，已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，批準編號：SLBH-202312200001。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1主要儀器小動物實驗跑步機（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號：ZS-PT-ⅡI）；自制實驗動物按法儀（專利號：ZL202320894776.7）；智能推拿手法參數測定系統（上海中宏科教設備有限公司，型號：ZTC-ⅡI）;電子節拍器（杭州藝鈦樂器有限公司，型號：AM-705）；寵物脫毛剃毛器（奧克斯集團有限公司，型號：AUX-C5）：凝膠電泳成像儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司，型號：BG-subMIDI）；化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）。

1.2.2主要試劑腫瘤壞死因子- σ?α∝ （tumor necrosisfactor-alpha，TNF- σ?α?α?α?α ）、白細胞介素 -1β （interleukin-1beta，IL-1β）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號：ED-31063ED-30206、JM-01582R2）；異氟烷（山東安特牧業科技有限公司，批號：2023101602）；扶他林乳膠劑（北京諾華制藥有限公司，批號：H20181225）；蛋白提取液、蛋白酶抑制劑、羊抗兔IgG-HRP（北京百奧思科生物技術有限公司，批號：MDL91201、MD912893、MD912565）；Actin抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：AF7018）;PI3K抗體、Akt抗體、p-Ak抗體（上海貝博生物科技有限公司，批號：A19805、A10447、A10442）：醫療用凡士林（英科醫療科技股份有限公司，批號：ACQ038-2023）。

1.3 動物分組與造模

1.3.1動物分組采用隨機數字表法將32只雄性SD大鼠分為空白組（8只）和造模組（24只）。造模完成后，再將造模組大鼠按照隨機數字表法分成模型組、推法組和藥物組，每組8只。

1.3.2造模方法造模組大鼠參照Armstong離心運動，使用小動物實驗跑步機采取下坡跑離心運動制作骨骼肌過勞性損傷模型大鼠，具體操作如下。先讓大鼠適應性運動5d：第1、2天，以 的速度在 0^° 的角度行走，持續 10min ；第3、4天，同樣的速度下，傾斜度調整為 -5^° ，行走時間延長至15min ;第5天，傾斜度增加到 -10^° ，速度保持不變，行走時間延長至 30min ，每天1次。適應性運動 5d 后休息2d，開始進行為期4周的離心運動（6d/周）。第1周：傾斜度 -16°，60min，16m/min ;第2周：傾斜度 -16^°，60min，20m/min ；第3、4周：傾斜度 -16^° ， 。造模完成 24h 后進行平衡木測試，觀察大鼠通過平衡木時間延長、滑爪次數增加，表明造模成功[10-12]

1.4 干預方法

造模完成 24h 后，對推法組和藥物組進行相應治療。推法組和藥物組治療過程中，用黑色透氣棉布包裹大鼠頭面部，防止大鼠在治療過程中掙扎。

推法組大鼠露出右后肢腓腸肌及相鄰肌肉部位，進行剃毛處理并均勻涂抹醫用凡士林。為解決動物實驗中徒手推法難以規范化和量化的問題，使用本團隊設計的自制實驗動物按法儀，并配合電子節拍器控制操作時間及頻率[13]。干預前，使用按法儀在智能推拿手法參數測定系統測試3次以上，以保證操作規范。故使用自制實驗動物按法儀將硅膠接觸頭置于大鼠右后肢腓腸肌部位，并通過按法儀力度定位銷控制下壓力度，隨后朝大鼠右后肢腓腸肌近心端方向，施以單方向直線推動，推法下壓力約為 2N^[14-15] 為達到深度按摩效果，頻率為80次 /min^[16] 3min 次，每天上午、下午各干預1次，共持續 3d 。藥物組給予適量扶他林乳膠劑均勻涂抹于大鼠右后肢腓腸肌部位，治療時間為上午9：00和下午4：00，共持續3d_o 空白組和模型組僅進行頭面部包裹及涂抹醫用凡士林處理，以確保實驗協同性。

1.5 取材

分別于造模結束 24h 后和干預結束 24h 后，采用平衡木測試評估大鼠骨骼肌損傷后的運動協調性。平衡木測試結束后，使用 2% 異氟烷對大鼠進行呼吸麻醉。進行腹腔采血，全血樣本室溫靜置 ¹h （離心半徑 7cm 離心 10min ，分離血漿凍存于 -80°C 冰箱備用。剝離大鼠右后肢腓腸肌組織，分為3份，1份采用 4% 多聚甲醛浸泡固定，另外2份凍存于 -80°C 冰箱，用于后續ELISA檢測和Westernblot檢測。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1平衡木測試大鼠穿過木梁所需行走時間及滑爪次數將木梁 2cm×120cm 放置在距地面 120cm 的高度，暗箱位于木梁一端，使大鼠從木梁另一端走進暗箱，記錄大鼠穿過木梁后到達暗箱所需行走時間和滑爪次數，記錄3次測試結果并計算平均值。每次測試后，用 75% 乙醇擦拭木梁和暗箱。

1.6.2HE 染色觀察大鼠腓腸肌組織形態取大鼠右后肢腓腸肌組織，將其浸泡于 4% 多聚甲醛中過夜，依次脫水、包埋、切片、染色、脫水、封裝，用顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6.3ELISA檢測血漿中TNF- ??α，IL-1β IL-8含量設置孔位，加入標準液，放入待測大鼠腓腸肌組織樣本，加入抗體，密封孵育，加入底物孵育，添加終止液，測量OD值。

1.6.4Western blot檢測腓腸肌組織中PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達將腓腸肌組織勻漿后，加入裂解液 ，4C，12000r/min（ （離心半徑 7cm 離心 15min 收集上清液；BCA蛋白定量法測定蛋白濃度；電

泳、轉膜、封閉;PI3K、Akt、p-Akt抗體（均1：1 000）， β- actin抗體（1：3000），4 C 孵育過夜;洗滌后加入二抗（1：300），室溫孵育 ¹h ；化學發光成像系統獲取蛋白條帶，ImageJ軟件分析。

1.7 統計學方法

本研究采用SPSS26.0統計軟件進行數據分析。計量資料服從正態分布以“ ”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗，方差不齊則采用Tamhan'sT2檢驗。均以 Plt; 0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠治療前后平衡木行走時間及滑爪次數比較

與治療前比較，推法組、藥物組大鼠治療后平衡木行走時間均縮短、滑爪次數均減少 （Plt;0.01） 。治療后，與空白組比較，模型組大鼠平衡木行走時間延長、滑爪次數增加（ （Plt;0.01） ；與模型組比較，推法組、藥物組大鼠平衡木行走時間縮短、滑爪次數減少（ Plt; 0.01）。詳見表1。

表1各組大鼠治療前后平衡木行走時間及滑爪次數比較

注：與治療前比較， ；與空白組比較， **Plt;0.01 ;與模型組比 較， ^##Plt;0.01 ○

2.2各組大鼠腓腸肌組織形態學結果

空白組大鼠腓腸肌的肌纖維排列緊密有序，肌束完好，橫紋分明；模型組腓腸肌可見明顯的炎癥細胞浸潤：推法組胖腸肌炎癥細胞明顯減少；藥物組可見腓腸肌炎癥細胞浸潤，但與模型組相比較少，與推法組相比較多。詳見圖1。

2.3各組大鼠血漿中TNF- σ?α?α?α?α IL-1β 、IL-8含量比較與空白組相比，模型組TNF- ??a，IL-1β 及IL-8含量升高 （Plt;0.01） ；與模型組相比，推法組、藥物組IL-1β、IL-8含量降低 （Plt;0.05，Plt;0.01） ；與推法組相比，藥物組IL-8含量升高 （Plt;0.05） 。詳見表2。

表2各組大鼠血漿中TNF- α_α 、IL-1β、IL-8含量比較 Table 2Comparison of content of TNF- ?ααα， IL- ?1β， and IL-8 inplasma among different groups of rats （x±s， n=8 0

注：與空白組比較， **Plt;0.01 ；與模型組比較， ^*Plt;0.05，^**Plt;0.01 ；與推法組比較， ^ΔPlt;0.05 （204號

2.4各組大鼠腓腸肌組織中P13K、Akt、p-Akt蛋白表達量比較

與空白組相比，模型組PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達量升高（ Plt;0.01） ；與模型組相比，推法組PI3K、Akt蛋白表達量升高 （Plt;0.05，Plt;0.01） ），藥物組PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達量升高 （Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見表3、圖2。

表3各組大鼠腓腸肌組織中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達量比較 ）

Table3Comparison of protein expression levelsof PI3K，Akt，and in the gastrocnemius muscle tissueamong different groups of rats （x±s， n=8 ）

注：與空白組比較， **Plt;0.01 ；與模型組比較， ^*Plt;0.05，^**Plt;0.01 。

圖1大鼠骨骼肌組織形態變化（HE， ×200 ）

Fig.1Morphological changes in rat skeletal muscle （HE ×200 ）

注：黑色箭頭所指為炎癥細胞。

圖2各組大鼠腓腸肌組織中PI3K/Akt信號通路蛋白磷酸化電泳條帶圖

Fig.2Phosphoprotein electrophoretic bands of PI3K/Akt signaling pathway in gastrocnemius muscle tissue among different groups of rats

3討論

骨骼肌過勞性損傷是指因長期、反復或過度使用骨骼肌，超出其自我修復能力，導致肌肉組織微損傷累積，引發的結構或功能異常。中醫學將骨骼肌過勞性損傷歸屬于“筋傷\"或“痹病\"等范疇，核心病機為局部氣血運行不暢、筋脈失養、經筋受損、經絡阻塞等。此類損傷會引發炎癥，導致肌肉痙攣、萎縮，形成瘢痕甚至粘連，這些病理改變可能阻礙局部的血液流動，造成肌肉組織血液供應不足、缺氧，從而引發肌肉組織的疼痛、麻木、無力等癥狀。骨骼肌過勞性損傷后，多種炎癥因子參與的炎癥反應在修復過程中發揮重要作用。

TNF- σ?α?α?β∝β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α?β?α 是評估受損部位炎癥嚴重程度的一個重要指標，由活化的巨噬細胞釋放，是介導炎癥反應的關鍵炎癥因子[18。在損傷早期階段，炎癥級聯反應主要源自肌纖維的壞死與水腫，激活肥大細胞和巨噬細胞，異常分泌T VF-α，IL-1β 和IL-6等炎癥因子，加劇炎癥反應[。因此，修復骨骼肌損傷首先要降低T ΔNF-α，IL-1β 和IL-6等炎癥因子的表達水平。在炎癥反應發生過程中，PI3K/Akt/mTOR信號通路會被激活，該通路對中性粒細胞和巨噬細胞在細胞外基質外的黏附、遷移功能具有關鍵調控作用[20]。中性粒細胞發生凋亡，隨后由巨噬細胞介導吞噬作用，是炎癥發生過程中必不可少的組成部分2]。已有研究證實，I型PI3K可能通過調控Akt磷酸化水平，影響細胞因子依賴的中性粒細胞存活周期，而PI3K/Akt通路的活化對骨骼肌修復與再生具有顯著正向效應[22]。PI3K家族成員（如 PI3Kα 、PI3Kβ等）還能通過調節樹突狀細胞的CD80/CD86共刺激分子表達，進一步影響IL-6等炎癥因子的分泌，優化免疫細胞功能[2]。相關研究顯示，在Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLR）介導的炎癥反應中，對PI3K信號的抑制能夠降低巨噬細胞和樹突狀細胞分泌促炎因子，并促進抗炎細胞因子IL-10的分泌[23]。I型PI3K被揭示可能通過精細調控Akt的活化狀態，間接影響細胞因子所介導的中性粒細胞存活狀態，可以推斷PI3K/Akt信號通路在骨骼肌的再生機制中發揮調控功能[22]。本研究據此推測，推拿可能通過調控PI3K/Akt信號通路，來調節大鼠受損骨骼肌的炎癥水平，從而對骨骼肌過勞性損傷后的修復過程產生積極作用。

推法作為傳統的醫療技術，是臨床常用的理筋手法之一。運用推法作用于病變組織、經筋或穴位，具有疏通經絡、活血化瘀、緩解肌肉粘連等功效[24-25]，從而促進疾病臨床癥狀的改善和治愈。其創傷性低、不良反應少，臨床用于各類傷科疾病中療效明確[2，對軟組織慢性勞損改善效果顯著，故骨骼肌過勞性損傷時運用推法可促進其修復。本研究造模后行平衡木測試發現，與空白組比較，造模組大鼠平衡木行走時間延長、滑爪次數增加，表明造模成功。

扶他林乳膠劑的主要成分為雙氯芬酸二乙胺，是一種外用非甾體抗炎藥，主要作用機制是通過抑制環氧酶的活性，阻斷花生四烯酸轉化為前列腺素[8]。前列腺素是炎癥介質，能引起疼痛、腫脹和發熱，減少其合成可有效緩解局部炎癥反應，作為臨床較為常用的抗炎藥，適用于肌肉拉傷、關節扭傷、肌腱炎、滑膜炎等軟組織損傷，以及骨關節炎、類風濕性關節炎等慢性炎癥性疾病。推法和扶他林藥物兩種治療方式都是通過調控炎癥因子水平，抑制炎癥反應，達到修復骨骼肌的目的，故本實驗選用扶他林乳膠劑作為陽性對照藥物2。相較于口服非甾體抗炎藥，扶他林乳膠劑在透皮吸收性上得到了較好的保證，采用局部外用給藥方式，能夠直接作用于患處，減少全身性毒副作用（如胃腸道刺激、肝腎負擔等），安全性較高。使用時，取適量扶他林乳膠劑涂抹于疼痛或炎癥部位，輕輕按摩促進吸收，從而達到較好的鎮痛、抗炎等作用，相對非甾體抗炎藥其用藥局限性較小，可通過調控相關炎癥因子的表達，有效促進組織修復。病理染色結果顯示，與空白組比較，其他各組的骨骼肌都有不同程度的炎癥細胞浸潤；與模型組比較，推法組和藥物組治療后炎癥細胞浸潤程度皆有所改善。

本研究通過參照Armstong造模方案構建骨骼肌過勞性損傷大鼠模型，推法作為干預手段，參照相關治療參數，結果顯示，推法對骨骼肌過勞性損傷后修復具有促進作用。PI3K/Akt信號通路中，生理狀態下的細胞內PI3K表達水平很低，損傷后活化、表達水平快速增高[28]；Akt則需經雙磷酸化機制激活，其二次磷酸化位點 p-Akt（Ser473） 將充分發揮Akt的生物功能活性，促進細胞存活[2]。本研究結果顯示，推法治療可縮短骨骼肌過勞性損傷大鼠平衡木行走時間，減少滑爪次數，減輕炎癥細胞浸潤程度，改善慢性骨骼肌損傷和運動功能，其作用機制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路，調節相關炎癥因子及PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達，進而改善肌肉組織結構，顯著抑制骨骼肌炎癥水平，促進骨骼肌修復。但本研究存在一定局限性，實驗治療時間較短，未對各個時間段的治療情況進行對比，通路中蛋白與蛋白之間的調控聯系有待進一步探索。

綜上所述，骨骼肌過勞性損傷在推法干預下具有顯著的修復效果，其作用機制可能通過激活PI3K/Akt信號通路，并調控相關炎癥因子及蛋白表達，發揮修復作用，為臨床應用推法治療骨骼肌過勞性損傷提供了理論基礎和新思路

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（本文編輯 匡靜之）