溫陽(yáng)利水方對(duì)肺動(dòng)脈高壓致右心室衰竭大鼠心室重構(gòu)的影響

中圖分類號(hào) R965；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào)1001-0408（2025）20-2531-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.20.08

ImpactofWenyang lishui formulaon ventricular remodeling inratswithpulmonary hypertension-induced rightheartfailure

FENG Sijian12，HUANG Yan23，XING Aimin2：4，YUAN Mei2.5，LIU Yafang2，4，WANG Weiming2，4（1. Dept. One of Cardiovascular Medicine，Hongqi Hospital Afiliated to Mudanjiang Medical University，Heilongjiang Mudanjiang，China；2.The First Clinical Medical Colege，Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Mudanjiang 1570，China;3.Dept.of Rheumatic Immunology，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University，Heilongjiang Mudanjiang 1570o0，China;4. Dept. of Respiratory and Critical Care Medicine，Hongqi Hospital Afiliated to Mudanjiang Medical University，Heilongjiang Mudanjiang ，China;5.Dept.of Respiratory Medicine，Hongqi Hospital Afiliated to Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Mudanjiang 157ooo，China）

ABSTRACTOBJECTIVETo discusstheimpact of Wenyang lishui formulaon ventricularremodeling in rats with pulmonary hypertension-inducedrightheartfailure（RHF）basedontheHippo/Yes-asociatedprotein（YAP）signalingpathway.METHODS Tenratswererandomlyselectedasthecontrolgroup.Theremaining63ratsweregivenasingleintraperitonealinjectionof monocrotaline toestablishthepulmonaryhypertension-inducedRHFmodel.The5Oratsthatsucesfullyunderwentthemodel establishment were randomly divided into the RHF group，low-dose group of Wenyang lishui formula （4.25g/kg） ），high-dose group of the Wenyang lishui formula （17.00g/kg ），furosemide group 20mg/kg ），and high-dose group of Wenyang lishui formula+

Hippo/YAP signaling pathway activator group（ 17.00g/kg of Wenyang lishui formula ⁺¹⁶ 1 mg/kg of PY-60），with 10 rats in each group.The rats in each group were given the corresponding drug solution or normal saline by gavage or/and tail vein injection，once a day，for 4 consecutive weeks. During the experiment，the general conditions of the ratsin

eachgroupwereobserved；aftertheastadministration，therightventriculardiameter，ightatrialdiameter，ed-dastolicvolume， pulmonaryarterybloodflowacelerationtime（PAAT）anditsratiotoejection time（ET）（PAAT/ET），pulmonaryarterypresure anditsrtiotopulmonaryarterialflowvelocity（pulmonaryarterypressure/velocity）were measured.The plasma levelsof brain natriureticpeptideandangiotensinI（AngII）weredetected.Thepathologicalchangesoftherightventriculartisuwere observed，andthecolagenvolumefraction，thephosphorylationlevelsofthelargetumorsuppresor1/2（LAT1/2）andYAP，and theproteinexpressonof thetranscriptionalcoactivatorofPDZ-bindingmotif（TAZ）werealsodetected.RESULTSComparedwith theRHFgroup，therats in Wenyang lishuiformula low-doseand high-dosegroupsshowedimprovedhaircolor，movement，diet， andmentalstate.Theatrophyofrightventricularmyocardialcels，theincreaseof inflammatorycells，collagendeposition，and hypertrophyofmyocardialberseresigificantlyaleviated.Terightventricularintealdameter，ightatrialinteraldiaete end-diastolicvolume，pulmonaryarterypressure，pulmonaryarterypressre/velocity，theplasmalevelsofbrainnatriureticpeptide andAngI，collagenvolumefraction，thephosphorylationlevelofYAPandproteinexpressonofTAZweresignificantly decreased，while the PAAT，PAAT/ETand the phosphorylation level ofLATS1/2 were significantly increased （Plt;0.05 ）.PY-60 could significantlyreverse theimprovementefectsof high-dose Wenyang lishui formulaontheabovequantitativeindicators（ Plt; 0.05）.CONCLUSIONs Wenyang lishui formulacanrestoretheright heart functionof pulmonaryhypertension-inducedRHFrats， reduce theirpulmonaryarterypressure，aleviatethepathologicalchanges intheircardiactissues，andtheaboveefects maybe related to the activation of Hippo expression and the inhibition of YAP phosphorylation.

KEYWORDSWenyanglishuiformula；pulmonaryhypertension；right heartfailure；ventricularremodeling；Hippo/YAF signaling pathway

肺動(dòng)脈高壓是一種進(jìn)行性且危及生命的心肺血管疾病，以不可逆的肺血管重塑和持續(xù)的肺血管收縮為主要特征。內(nèi)皮素受體拮抗劑、鈣離子通道阻滯劑等臨床常用藥物雖可擴(kuò)張患者肺血管、改善其血流動(dòng)力學(xué)，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的肺血管重塑；而持續(xù)的后負(fù)荷驅(qū)動(dòng)可使右心室發(fā)生幾何重構(gòu)，最終演變?yōu)橛倚氖宜ソ撸╮ightheartfailure，RHF）——這是肺動(dòng)脈高壓的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，也是患者死亡的主要原因之一[-2]。研究指出，由肺血管重塑引發(fā)的心室重構(gòu)是心室衰竭的基本病理過(guò)程，包括血管病變、間質(zhì)纖維化、心律失常等改變，上述改變可進(jìn)一步形成“重構(gòu)-衰竭\(yùn)"惡性循環(huán)[-4]。可見(jiàn)，抑制心室重構(gòu)可能是改善心室衰竭的有效途徑之一。

溫陽(yáng)利水方由炙鱉甲、川芎、白術(shù)、附子、白芍、臍帶、鹿角片、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、茯苓、豬苓組方而成，是國(guó)醫(yī)大師嚴(yán)世蕓教授治療心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，具有溫陽(yáng)利水、活血化瘀、補(bǔ)腎健脾等功效，用于陽(yáng)虛水泛、血瘀內(nèi)阻等所致多種病癥的治療，在心功能保護(hù)及內(nèi)皮功能改善中具有重要作用。由此本課題組推測(cè)，溫陽(yáng)利水方可能對(duì)心室重構(gòu)所致RHF具有積極作用。Hippo/Yes相關(guān)蛋白（Yes-associatedprotein，YAP）作為調(diào)控器官生長(zhǎng)、組織修復(fù)及纖維化發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)通路，其異常激活與心臟疾病的進(jìn)展密切相關(guān)：YAP在心力衰竭患者心臟組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，并可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖、肥大和纖維化等病理改變的發(fā)生；此外，活化的YAP可進(jìn)一步加速心肌纖維化及心室重構(gòu)，在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6。由此本課題組推測(cè)，溫陽(yáng)利水方或可通過(guò)調(diào)節(jié)陽(yáng)虛、血瘀等病理狀態(tài)，影響Hippo/YAP信號(hào)通路上下游信號(hào)分子，從而抑制該信號(hào)通路的異常激活，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞的病理改變。基于此，本研究擬建立肺動(dòng)脈高壓致RHF大鼠模型，初步探討溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠心室重構(gòu)的影響及潛在機(jī)制，以期為相關(guān)新藥的研發(fā)提供參考。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用主要儀器包括BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）、VividE9型彩色多普勒超聲診斷儀（美國(guó)GE公司）、ThermoMultiskanMK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisherScientific公司）等。

1.2主要藥品與試劑

炙鱉甲、川芎、白術(shù)、附子、白芍、臍帶、鹿角片、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、茯苓、豬苓飲片（批號(hào)分別為240114、231122、231006、231113、231121、240816、231105、240321、230903、240424、231109）均購(gòu)自哈爾濱普方藥業(yè)飲片有限公司，由牡丹江醫(yī)科大學(xué)附屬紅旗醫(yī)院藥學(xué)部王加良副主任藥師鑒定，均為真品。

呋塞米對(duì)照品（陽(yáng)性對(duì)照，純度 98% ，批號(hào)KM11136725）購(gòu)自溫州科淼生物科技有限公司；PY-60對(duì)照品（Hippo/YAP信號(hào)通路激活劑，純度 98% ，批號(hào)HY-141644）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；野百合堿對(duì)照品（純度 98% ，批號(hào)JS3172）購(gòu)自湖北巨勝科技有限公司；血管緊張素ⅡI（angiotensinⅡI，AngII）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)FY-A014534）購(gòu)自上海富雨生物科技有限公司；腦鈉肽ELISA試劑盒（批號(hào)KL15150）購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司；兔抗大腫瘤抑制因子1/2（large tumor suppressor1/2，LATS1/2）抗體、兔抗磷酸化LATS1/2（phosphorylated LATS1/2，p-LATS1/2）抗體、兔抗磷酸化YAP（phosphorylatedYAP，p-YAP）抗體、兔抗YAP抗體、兔抗PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-bindingmotif，TAZ）抗體、鼠抗 _?β -肌動(dòng)蛋白（ β -actin）抗體及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（Hamp;L）（批號(hào)分別為ab264475、ab305029、ab76252、ab52771、ab307440、ab8226、ab205719）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)GB23303）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；Masson染液（批號(hào)JK-182）購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染液（批號(hào)G1120）購(gòu)自北京索寶萊科技有限公司；RIPA裂解緩沖液（批號(hào)P0013）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠（7周齡，體重 250～280g 購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（黑）2024-002。所有大鼠均在溫度 20～25^°C. 相對(duì)濕度 50%～60% 每 12h 光照/黑暗循環(huán)的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)程序均遵循動(dòng)物護(hù)理和使用的相關(guān)指南，并通過(guò)牡丹江醫(yī)科大學(xué)附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)20240129）。

2方法

2.1 藥液制備

取炙鱉甲、川芎、白術(shù)、附子、白芍、臍帶、鹿角片飲片各 10g ，補(bǔ)骨脂、淫羊藿、茯苓、豬苓飲片各 15g ，混合，加8倍量水浸泡 30min ，以武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮 1.5h 過(guò)濾；藥渣再加6倍量水，煎煮1h，過(guò)濾；合并兩次濾液，減壓濃縮，制得溫陽(yáng)利水方浸膏（每 1mL 浸膏約含生藥量 3g ）

2.2 造模、分組與給藥

所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)選取10只大鼠，作為對(duì)照組。其余63只大鼠按下法構(gòu)建肺動(dòng)脈高壓致RHF模型[：大鼠單次腹膜內(nèi)注射野百合堿（ 60mg/kg 以無(wú)水乙醇為溶劑）誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓；6周后，大鼠經(jīng)多普勒超聲診斷儀檢查，若出現(xiàn)心功能不全（右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積明顯升高），則表明肺動(dòng)脈高壓致RHF模型構(gòu)建成功。在此過(guò)程中，有8只大鼠死亡、5只不符合造模標(biāo)準(zhǔn)。將造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為RHF組、溫陽(yáng)利水方低劑量組（溫陽(yáng)利水方-低組）溫陽(yáng)利水方高劑量組（溫陽(yáng)利水方-高組）呋塞米組和溫陽(yáng)利水方高劑量+Hippo/YAP信號(hào)通路激活劑組（溫陽(yáng)利水方-高+PY-60組），每組10只。參考預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)]，溫陽(yáng)利水方-低、高組大鼠分別灌胃 4.25，17.00g/kg 的溫陽(yáng)利水方（以生藥量計(jì)，以水為溶劑）并同時(shí)尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周；參考預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)[]，呋塞米組大鼠灌胃 20mg/kg 的呋塞米（以二甲基亞砜為溶劑）并同時(shí)尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周;參考預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)，溫陽(yáng)利水方-高 +PY-60 組大鼠灌胃 17.00g/kg 的溫陽(yáng)利水方并同時(shí)尾靜脈注射 16mg/kg 的PY-60（以二甲基亞砜為溶劑），每天1次，連續(xù)4周；對(duì)照組和RHF組大鼠灌胃并同時(shí)尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.3 大鼠一般狀況觀察

實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組大鼠的皮毛狀況、精神狀態(tài)、飲食及活動(dòng)情況。

2.4大鼠右心功能指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后，將各組大鼠麻醉，置于加熱墊上，維持其體溫為 ，以多普勒超聲診斷儀檢測(cè)其右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積。連續(xù)收集3個(gè)心動(dòng)周期的數(shù)據(jù)，結(jié)果取平均值。

2.5大鼠右心-肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

心臟超聲檢查結(jié)束后，繼續(xù)以多普勒超聲診斷儀檢測(cè)各組大鼠的肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間（pulmonaryarterybloodflowaccelerationtime，PAAT）及其與射血時(shí)間（ejectiontime，ET）的比值（PAAT/ET）、肺動(dòng)脈壓及其與肺動(dòng)脈血流速度的比值（肺動(dòng)脈壓/速度）。連續(xù)收集3個(gè)心動(dòng)周期的數(shù)據(jù)，結(jié)果取平均值。

2.6大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡ水平檢測(cè)

肺動(dòng)脈超聲檢查結(jié)束后，采集各組大鼠尾靜脈血，將血樣置于含乙二胺四乙酸的抗凝管中，于 4^°C 下以1200×g 離心 15min ，分離上層血漿，按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，以酶標(biāo)儀檢測(cè)其腦鈉肽、AngⅡ水平。

2.7大鼠心臟組織病理學(xué)變化觀察

2.7.1 HE染色

采血后，將各組大鼠處死，迅速打開(kāi)胸腔，剖取心臟，分離右心室，剝離脂肪及結(jié)締組織后，取部分凍存，備用；取另一部分經(jīng) 4% 甲醛溶液固定后，行常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度 5μm ）。取上述切片，經(jīng)脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色（ 3min ）、分化、伊紅染色（5s）、脫水、封片后，使用顯微鏡觀察其心臟組織病理改變。

2.7.2 Masson染色

取“2.7.1\"項(xiàng)下各組大鼠的右心室組織切片，經(jīng)脫蠟、復(fù)水、Masson染色、風(fēng)干、透明、封片后，使用顯微鏡觀察其心臟組織纖維化改變（其中，紅細(xì)胞、纖維素、肌纖維呈紅色，膠原纖維、軟骨呈藍(lán)色），并采用ImageJ軟件計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)，即染色陽(yáng)性面積（藍(lán)色）占總面積的百分比。

2.8大鼠心臟組織中Hippo/YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Westernblot法檢測(cè)。取“2.7.1\"項(xiàng)下各組大鼠凍存的心臟組織，加入裂解緩沖液提取其總蛋白，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度后作變性處理。取變性蛋白，進(jìn)行8%～12% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，以脫脂牛奶封閉；洗膜后，加入p-LATS1/2、LATS1/2、p-YAP、YAP、TAZ ??β -actin（稀釋度均為1：500）一抗，于 4^°C 下孵育過(guò)夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度均為1：1000），于室溫下孵育60min ;洗膜后，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液曝光、顯影、成像。使用ImageJ軟件，以各目的蛋白與內(nèi)參蛋白（ β_β -actin）的灰度值比值表示各目的蛋白的表達(dá)水平，以p-LATS1/2與

LATS1/2、p-YAP與YAP蛋白的灰度值比值表示LATS1/2、YAP蛋白的磷酸化水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS27.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05 。

3結(jié)果

3.1溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠一般情況的影響

對(duì)照組大鼠一切正常；RHF組大鼠毛色灰暗，運(yùn)動(dòng)及飲食均減少，精神狀態(tài)差，反應(yīng)遲鈍；溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠的毛色、運(yùn)動(dòng)及飲食、精神狀態(tài)等均有所改善，其中溫陽(yáng)利水方-高組、呋塞米組的改善更明顯；而溫陽(yáng)利水方-高+PY-60組大鼠的一般情況接近于溫陽(yáng)利水方-低組。

3.2 溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠右心功能指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，RHF組大鼠的右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積均顯著升高 （Plt;0.05） ；與RHF組比較，溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠的右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積均顯著降低，且溫陽(yáng)利水方-高組、呋塞米組大鼠上述指標(biāo)的改善均較溫陽(yáng)利水方-低組明顯0 （Plt;0.05） ；與溫陽(yáng)利水方-高組比較，溫陽(yáng)利水方-高 + PY-60組大鼠的右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1各組大鼠右心功能指標(biāo)比較 0

a：與對(duì)照組比較， Plt;0.05：0 與RHF組比較， Plt;0.05 ;c：與溫陽(yáng)利水方-低組比較， ：與溫陽(yáng)利水方-高組比較， Plt;0.05 。

3.3溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠右心-肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，RHF組大鼠的PAAT、PAAT/ET均顯著降低，肺動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓/速度均顯著升高（ Plt; 0.05）；與RHF組比較，溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠的PAAT、PAAT/ET均顯著升高，肺動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓/速度均顯著降低，且溫陽(yáng)利水方-高組、呋塞米組大鼠上述指標(biāo)的改善均較溫陽(yáng)利水方-低組明顯（ （Plt;0.05） ：與溫陽(yáng)利水方-高組比較，溫陽(yáng)利水方-高+PY-60組大鼠的PAAT、PAAT/ET均顯著降低，肺動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓/速度均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡ水平的影響

與對(duì)照組比較，RHF組大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡ水平均顯著升高（ ）；與RHF組比較，溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡI水平均顯著降

表2各組大鼠右心-肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 s，n=10）

a：與對(duì)照組比較， Plt;0.05 ;b：與RHF組比較， Plt;0.05 ;c：與溫陽(yáng)利水方-低組比較， Plt;0.05 ;d：與溫陽(yáng)利水方-高組比較， Plt;0.05 1mmHg=0.133kPa_o

低，且溫陽(yáng)利水方-高組、呋塞米組大鼠上述指標(biāo)的改善均較溫陽(yáng)利水方-低組明顯 （Plt;0.05 ；與溫陽(yáng)利水方-高組比較，溫陽(yáng)利水方-高 +PY-60 組大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡ水平均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3各組大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡ水平比較 10，ng/mL）

a：與對(duì)照組比較， Plt;0.05：0 與RHF組比較， Plt;0.05 ;c：與溫陽(yáng)利水方-低組比較， Plt;0.05 ；d：與溫陽(yáng)利水方-高組比較， Plt;0.05， 。

3.5溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠心臟組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠右心室組織結(jié)構(gòu)正常；RHF組大鼠右心室可見(jiàn)心肌細(xì)胞萎縮、炎癥細(xì)胞增多、心肌結(jié)構(gòu)紊亂，且肌纖維排列紊亂；溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠右心室組織肌纖維排列逐漸有序，心肌細(xì)胞萎縮減少，其中溫陽(yáng)利水方-高組和呋塞米組的改善更明顯；而溫陽(yáng)利水方-高+PY-60組大鼠右心室組織損傷程度接近于溫陽(yáng)利水方-低組。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1各組大鼠心臟組織病理改變的顯微圖（HE染色）

Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠右心室無(wú)明顯纖維組織增生，其膠原容積分?jǐn)?shù)為 （2.24±0.28）% ;RHF組大鼠右心室膠原沉積和心肌纖維增生明顯，膠原容積分?jǐn)?shù)[ （16.81±1.73）% 較對(duì)照組顯著升高 Plt;0.05 ；溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠右心室心肌纖維增生、膠原沉積明顯減少，膠原容積分?jǐn)?shù) [（10.02±1.14）% ！（5.21±0.66）% ！ （5.13±0.62）%] 均較RHF組顯著降低，且溫陽(yáng)利水方-高組、呋塞米組大鼠上述指標(biāo)的改善均較溫陽(yáng)利水方-低組明顯（ Plt;0.05 ）；而溫陽(yáng)利水方-高 + PY-60組大鼠右心室纖維化程度接近于溫陽(yáng)利水方-低組，其膠原容積分?jǐn)?shù)[ 10.54±1.17）% 較溫陽(yáng)利水方-高組顯著升高（ Plt;0.05 ）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2各組大鼠心臟組織纖維化變化的顯微圖（Masson染色）

3.6溫陽(yáng)利水方對(duì)大鼠Hippo/YAP通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，RHF組大鼠心臟組織中LATS1/2蛋白的磷酸化水平顯著降低，YAP蛋白的磷酸化水平和TAZ蛋白的表達(dá)均顯著升高或上調(diào)（ （Plt;0.05） ；與RHF組比較，溫陽(yáng)利水方-低、高組和呋塞米組大鼠心臟組織中LATS1/2蛋白的磷酸化水平顯著升高，YAP蛋白的磷酸化水平和TAZ蛋白的表達(dá)均顯著降低或下調(diào)，且溫陽(yáng)利水方-高組、呋塞米組大鼠上述指標(biāo)的改善均較溫陽(yáng)利水方-低組明顯 （Plt;0.05 ）；與溫陽(yáng)利水方-高組比較，溫陽(yáng)利水方-高 +PY-60 組大鼠心臟組織中LATS1/2蛋白的磷酸化水平顯著降低，YAP蛋白的磷酸化水平和TAZ蛋白的表達(dá)均顯著升高或上調(diào)（ （Plt;0.05 ）。結(jié)果見(jiàn)圖3、表4。

I：對(duì)照組；I：RHF組；II：溫陽(yáng)利水方-低組；IV：溫陽(yáng)利水方-高組；V：呋塞米組;VI：溫陽(yáng)利水方-高+PY-60組。

圖3各組大鼠心臟組織中p-LATS1/2、LATS1/2、p-YAP、YAP、TAZ蛋白表達(dá)的電泳圖

4討論

肺動(dòng)脈高壓是起病隱匿且進(jìn)展迅速的致命疾病。 隨著病情的發(fā)展，該病會(huì)進(jìn)展為右心室病變，進(jìn)而引發(fā)

表4各組大鼠心臟組織中LATS1/2、YAP蛋白磷酸化和TAZ蛋白表達(dá)水平比較 ）

a：與對(duì)照組比較， Plt;0.05 ；b：與RHF組比較， ΔPlt;0.05 ;c：與溫陽(yáng)利水方-低組比較， Plt;0.05 ；d：與溫陽(yáng)利水方-高組比較， Plt;0.05 。

RHF，故右心室功能是肺動(dòng)脈高壓患者預(yù)后的重要指標(biāo)[2]。呋塞米可改善患者體液潴留、減輕心臟負(fù)荷、緩解RHF癥狀[，遂本研究以呋塞米作為陽(yáng)性對(duì)照藥，以評(píng)價(jià)溫陽(yáng)水利方對(duì)肺動(dòng)脈高壓致RHF的作用。

中藥在RHF、肺心病等疾病的治療領(lǐng)域發(fā)揮了積極的作用，且相關(guān)臨床經(jīng)驗(yàn)豐富[13]。《內(nèi)經(jīng)》曰“心痹者，脈不通”，應(yīng)以化痰利水、活血化、益氣溫陽(yáng)等法治療心力衰竭，改善患者生活質(zhì)量[14。溫陽(yáng)利水方由炙鱉甲、川芎等11味中藥組方而成，其中炙鱉甲滋陰潛陽(yáng)、軟堅(jiān)散結(jié);川芎行氣活血，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等作用；鹿角片、補(bǔ)骨脂、淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、溫脾止瀉、納氣平喘等作用；茯苓、豬苓淡滲利水，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力；白術(shù)溫運(yùn)脾，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)；附子溫通心脈；臍帶填精補(bǔ)腎；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰正汗、柔肝正痛；諸藥合用，共奏溫補(bǔ)陽(yáng)氣、利水消腫之功[915]。本課題組前期對(duì)溫陽(yáng)利水方性狀、鑒別、指標(biāo)成分（阿魏酸、淫羊藿苷）含量及微生物限度等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了質(zhì)量控制，同時(shí)對(duì)所用飲片、提取方法進(jìn)行了考察、優(yōu)化，確保了溫陽(yáng)利水方提取工藝及質(zhì)量的穩(wěn)定性。同時(shí)，有研究初步證實(shí)了溫陽(yáng)利水方在治療肺源性心臟病中的顯著療效[56]，故本課題組推測(cè)其可能對(duì)肺動(dòng)脈高壓引發(fā)的RHF心室重構(gòu)也具有良好的改善效果。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RHF組大鼠毛色灰暗，運(yùn)動(dòng)及飲食均減少，精神狀態(tài)差且反應(yīng)遲鈍；右心室可見(jiàn)心肌細(xì)胞萎縮、炎癥細(xì)胞增多、膠原沉積、心肌纖維增生等改變，其右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積、肺動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓/速度、膠原容積分?jǐn)?shù)均顯著升高，PAAT、PAAT/ET均顯著降低。經(jīng)溫陽(yáng)利水方干預(yù)后，大鼠精神狀態(tài)及飲食、運(yùn)動(dòng)等一般狀況得到改善，心肌萎縮及膠原纖維減少，肌纖維排列逐漸有序；其右室內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑、舒張末期容積、肺動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓/速度、膠原容積分?jǐn)?shù)均顯著降低，PAAT、PAAT/ET均顯著升高，提示該方可改善模型大鼠的右心功能和肺動(dòng)脈高壓。

腦鈉肽是心力衰竭診斷和患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[7]，而AngⅡ則是重要的促血管生成因子[8]。研究指出，RHF的主要特征包括反應(yīng)性心臟纖維化和血管生成受阻，涉及促血管生成因子表達(dá)的改變，因此二者相互作用，共同推動(dòng)RHF心室重構(gòu)的病理演變[18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RHF組大鼠血漿腦鈉肽、AngI水平均顯著升高；經(jīng)溫陽(yáng)利水方干預(yù)后，大鼠血漿腦鈉肽、AngⅡ水平均顯著降低，提示溫陽(yáng)利水方可改善RHF大鼠的心室重構(gòu)。

Hippo/YAP信號(hào)通路在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用。研究指出，當(dāng)Hippo信號(hào)通路被激活后，上游信號(hào)可促使該通路下游激酶LATS1/2發(fā)生磷酸化并活化，活化后的LATS1/2可通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)進(jìn)一步調(diào)控YAP、TAZ的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和組織穩(wěn)態(tài)；同時(shí)，抑制YAP表達(dá)可打破上述穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致心功能受損、心臟纖維化發(fā)生，進(jìn)而影響心室重構(gòu)[]。此外，研究指出，Hippo/YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)相關(guān)[20。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RHF組大鼠心臟組織中YAP蛋白的磷酸化和TAZ蛋白的表達(dá)均顯著升高/上調(diào)，LATS1/2蛋白的磷酸化水平降低，提示激活YAP表達(dá)可促進(jìn)RHF的發(fā)展。經(jīng)溫陽(yáng)利水方干預(yù)后，大鼠心臟組織中YAP蛋白的磷酸化水平和TAZ蛋白的表達(dá)均顯著降低/下調(diào)，LATS1/2蛋白的磷酸化水平顯著升高，提示溫陽(yáng)利水方對(duì)RHF的改善作用可能與激活Hippo、抑制YAP表達(dá)有關(guān)。為驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究參考相關(guān)研究[2]，使用Hippo/YAP通路激活劑PY-60進(jìn)行反向驗(yàn)證，結(jié)果顯示，PY-60可顯著逆轉(zhuǎn)溫陽(yáng)利水方對(duì)RHF大鼠上述各定量指標(biāo)的改善作用，初步驗(yàn)證該方可通過(guò)調(diào)控Hippo/YAP信號(hào)通路來(lái)改善RHF大鼠的心室重構(gòu)。需要注意的是，溫陽(yáng)利水方-高 + PY-60組大鼠心臟組織的病理改變并未恢復(fù)至對(duì)照組水平，提示可能存在其他信號(hào)通路的協(xié)同作用。

綜上所述，溫陽(yáng)利水方可恢復(fù)RHF大鼠心功能，降低其肺動(dòng)脈壓，減輕其心臟組織病理改變，上述作用可能與激活Hippo、抑制YAP表達(dá)有關(guān)。但由于中藥涉及諸多靶點(diǎn)，肺動(dòng)脈高壓致RHF的機(jī)制也十分復(fù)雜，故具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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