補(bǔ)氣通竅方對(duì)免疫球蛋白A腎病大鼠腸道菌群及免疫平衡的調(diào)節(jié)作用研究

中圖分類(lèi)號(hào)R965；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）20-2512-07

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2025.20.05

Study on the regulatory effects of Buqi tongqiao formula on intestinal flora and immune balance in IgA nephropathyrats

XU Jinjiang'， ZHANG Man2，WU Qiuye'，GUI Xiongbin3（1. Graduate School，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 5302O0，China;2.Dept.of Scientific Research，the First Afliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China;3.Dept.of Otorhinolaryngology，the First Afiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China）

ABSTRACTOBJECTIVETo explore theregulatory efectsofBuqi tongqiao formulaonintestinalfloraand immunebalance in immunoglobulinAnephropathy（IgAN）rats basedonthe theoryof“treating different diseases with thesame therapy\".METHODS MaleSDratswererandomlyasigned totheNormal groupandthemodelinggroup.IgANratmodelswereestablishedinthe modelinggroupbyintragastricadministrationofbovineserumalbumin，subcutaneous injectionofcarbontetrachlorideandcastor oilmixture，andtailvein injectionoflipopolysaccharide.Succesfullymodeledratswere thenrandomlydividedintothemodel group（Model group），Buqi tongqiao formula low-dose group（BQTQ-L group），Buqi tongqiao formula high-dose group（BQTQHgroup），and positivecontrol group（BZPgroup），with15rats ineach group.BZPgroupreceived intragastricadministrationof benazepril hydrochloride （ [10mg/kg] ），while BQTQ-L and BQTQ-H groups were given Buqi tongqiao formula at doses of 9.81 and （20 19.62g/kg （calculated as raw herb weight），respectively.The Normal group and the Model group received an equal volume of normalsalineintragastrically，onceaday，for8consecutiveweeks.The24-hoururinarytotalprotein（24hUTP）contentswere

measured at weeks 8，10，12，14 and 16 of the experiment. Afterthe last administration，serumcreatinine（Scr）andblood ureanitrogen（BUN）contentsweredetected. Renal histopathological changes and glomerular IgA immune complex deposition were examined.Additionally，alterations in gut microbiota composition，the proportions of peripheral T helper cell 17（Thl7）and regulatoryTcell（Treg），as well as the

ratioof Th17andTreg（Th17/Treg），were analyzedacrossallgroups.RESULTSCompared withthe Model group，ratsinboth BQTQ-LandBQQ-Hgroupsshowed allviatedmesangialcell hyperplasia，reducedmatrix expansion，anddecreased IgAimmune complex deposition in the glomeruli. The 24h UTP contents （at weeks 14 and 16 in the BQTQ-L group；at weeks 12，14 and 16 intheBQTQ-Hgroup），ScrandBUNcontents，IgA-positiveareafluorescenceintensities，relativeabundancesofFirmicutes， Th17 cell proportions，and Th17/Treg were significantly decreased in both BQTQ-L and BQTQ-H groups （Plt;0.05 ）；while the Chaol，Observedspecies，Shannon，andSimpson（exceptforBQTQ-Hgroup）indexes，therelativeabundancesofBacteroidota， and the proportions of Treg were significantly increased （ ?lt;0.05 ）.Differential microbiota included c_Clostridia（BQTQ-L group vs.Model group）and g Ruminococcus （BQTQ-H group vs.Model group），etc.CONCLUSIONS Buqi tongqiao formula may allviaterenalijuryandexertarenalprotectiveeffectinIgANratsbymodulatingintestinalflorahomeostasisandTh7/reg immune balance.

KEYWORDSBuqitongqiao formula；immunoglobulinAnephropathy；intestinalflora；immune balance；treatingdiferent diseases with the same therapy

免疫球蛋白A腎病（immunoglobulinAnephropathy，IgAN）是以腎小球系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多，伴IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積為特征的一類(lèi)腎小球疾病，以反復(fù)發(fā)作性血尿、不同程度蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)，是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病]。IgAN是導(dǎo)致患者終末期腎病的重要原因之一，給其家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)2。目前，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇和免疫抑制劑等藥物常被臨床用于緩解IgAN患者的疾病進(jìn)展，但這類(lèi)藥物長(zhǎng)期使用可能增加患者感染、代謝紊亂的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且部分患者接受治療后仍會(huì)進(jìn)展為終末期腎病?？梢?jiàn)，探尋一種有效、安全的IgAN治療手段十分必要。

由腸道微生物群改變引起的黏膜免疫障礙已被證實(shí)是IgAN發(fā)病的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素。研究指出，失調(diào)的腸道菌群可通過(guò)T細(xì)胞依賴(lài)性途徑（細(xì)胞因子介導(dǎo)）和T細(xì)胞非依賴(lài)性途徑[Toll樣受體（Toll-likereceptor，TLR）連接]來(lái)促進(jìn)初始B細(xì)胞向IgA抗體分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)換，從而介導(dǎo)IgAN的發(fā)生發(fā)展，故靶向調(diào)節(jié)腸道菌群可能是緩解IgAN的潛在策略。

補(bǔ)氣通竅方是桂雄斌教授治療變應(yīng)性鼻炎（allergicrhinitis，AR）的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、黨參、甘草、蒼耳子、辛夷、細(xì)辛、荊芥、桔梗、魚(yú)腦石、升麻、柴胡組方而成。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)氣通竅方可通過(guò)調(diào)控輔助性T細(xì)胞17（Thelpercell17，Th17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcell，Treg）比值（Th17/Treg）來(lái)平衡免疫、改善腸道菌群，從而緩解同為免疫性疾病的AR。“異病同治\"是中醫(yī)理論辨證施治的重要體現(xiàn)，其核心在于針對(duì)不同疾病的相同病機(jī)進(jìn)行治療。研究指出，AR與IgAN均以正虛邪實(shí)、臟腑功能失調(diào)為基本病機(jī)，涉及肺、脾、腎三臟，治以益氣固表、扶正祛邪，與補(bǔ)氣通竅方益氣固表、扶正祛邪的功效相契合[7-8]?？梢?jiàn)，該方具有改善IgAN的潛力。基于此，本研究以牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和四氯化碳（ CCl₄ ）聯(lián)合誘導(dǎo)構(gòu)建IgAN大鼠模型，基于“異病同治”

理論評(píng)估補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠的改善作用，并通過(guò)觀(guān)察腸道菌群及T淋巴細(xì)胞亞群的變化來(lái)探討該方的潛在作用機(jī)制，以期為補(bǔ)氣通竅方“異病同治\"科學(xué)內(nèi)涵的闡釋及其臨床應(yīng)用提供參考。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用主要儀器包括YJX20/1型循環(huán)煎藥包裝組合機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司），BS-240VET型全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），CytoFLEXS型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BeckmanCoulter公司），BX63型正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），ASP300S型全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司），Histostar型組織包埋機(jī)、HM355S型病理切片機(jī)（美國(guó)Thermo FisherScientific公司）， DP360 型全自動(dòng)封染一體機(jī)（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

黃芪、黨參、荊芥、柴胡、桔梗、升麻、辛夷飲片均購(gòu)自廣西仙茱中藥有限公司（批號(hào)分別為20240103、20240103、20240601、20240201、20240201、20231101、20240304），蒼耳子、甘草飲片均購(gòu)自廣西萬(wàn)寶堂藥業(yè)有限公司（批號(hào)分別為240304601、240300805），細(xì)辛飲片購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司（批號(hào)為2403101），魚(yú)腦石飲片購(gòu)自四川宏康源藥業(yè)有限公司（批號(hào)為240301）；上述飲片均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房采購(gòu)，經(jīng)該院藥學(xué)部馬家寶副主任藥師鑒定，均為真品。

鹽酸貝那普利片（陽(yáng)性對(duì)照，批號(hào)0000077708，規(guī)格10mg 購(gòu)自浙江華海藥業(yè)股份有限公司；BSA、LPS（批號(hào)分別為V900933、L2880）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司； CCl₄， 蓖麻油（批號(hào)分別為C805332、69006811）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血清肌酐（serumcreati-nine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為10500045700、10500045200）均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、尿蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為G1120、

BC5655）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠IgA多克隆抗體（批號(hào)bs-10491R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)33107ES60）購(gòu)自翌圣生物科技股份有限公司；FITC標(biāo)記的抗大鼠CD3單克隆抗體（批號(hào)561801）購(gòu)自美國(guó)BD公司；別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）/cyanine7標(biāo)記的抗大鼠CD4抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的抗大鼠CD25抗體、AlexaFluor？647標(biāo)記的抗大鼠叉頭框蛋白（forkheadboxprotein3，F(xiàn)OXP3）抗體（批號(hào)分別為201518、202105、320014）均購(gòu)自美國(guó)Bio-Legend公司；PerCP-eFluor710標(biāo)記的抗大鼠CD8a抗體、PE-cyanine7標(biāo)記的抗大鼠白細(xì)胞介素17A（interleu-kin-17A，IL-17A）抗體、細(xì)胞刺激試劑盒（批號(hào)分別為46-0084-82、25-7177-80、00-4975-93）均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體重 180～200g ，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境（溫度 25^°C ，相對(duì)濕度 50%～60% ，每 12h 光照/黑暗循環(huán)）內(nèi)，自由攝食、飲水。本研究方案經(jīng)過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)DW20240319-060）。

2 方法

2.1 藥液的制備

取黃芪、黨參、甘草、蒼耳子、辛夷、細(xì)辛、荊芥、桔梗、魚(yú)腦石、升麻、柴胡（質(zhì)量比 20：12：12：6：10：2：15：10 10：3：9） ，混勻，加12倍量水浸泡 30min ，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮 60min ，過(guò)濾；藥渣再次加12倍量水，同法煎煮，過(guò)濾；合并兩次濾液，于 50^°C 左右減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得質(zhì)量濃度為 3g/mL （以生藥量計(jì)）的濃縮液，于 -20^°C 下保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

取SD大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組（Normal組，17只）和造模組（63只）。取造模組大鼠，按照相關(guān)文獻(xiàn)方法并改進(jìn)，構(gòu)建IgAN大鼠模型：灌胃BSA溶液（以水為溶劑） 400mg/kg ，隔天1次，持續(xù)8周 + 皮下注射CCl4和蓖麻油混合液（體積比 1：3）0.4mL ，每周1次，持續(xù)8周 + 尾靜脈注射LPS[以磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑] ，于第6、8周各注射1次。于第8周末，隨機(jī)選取5只大鼠（Normal組2只，造模組3只）以免疫熒光法驗(yàn)證，若Normal組大鼠腎小球內(nèi)未見(jiàn)或少見(jiàn)IgA免疫復(fù)合物沉積，而造模組大鼠腎小球內(nèi)存在大量彌散性IgA免疫復(fù)合物沉積，則表明IgAN模型復(fù)制成功（具體操作見(jiàn)\"2.7\"項(xiàng)）。

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組（Model）組、補(bǔ)氣通竅方低劑量組（BQTQ-L組）、補(bǔ)氣通竅方高劑量組（BQTQ-H組）、陽(yáng)性對(duì)照組（BZP組），每組15只。BQTQ-L組、BQTQ-H組大鼠分別灌胃補(bǔ)氣通竅方9.81、19.62g/kg （以生藥量計(jì)，以生理鹽水為溶劑；基于“異病同治\"理論，分別以臨床等效劑量及其2倍作為BQTQ-L組、BQTQ-H組的劑量）；BZP組大鼠灌胃鹽酸貝那普利10mg/kg （以生理鹽水為溶劑，劑量參考預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)[設(shè)置）;Normal組和Model組大鼠灌胃等體積生理鹽水；每天1次，連續(xù)8周。

2.3 樣本收集

分別于實(shí)驗(yàn)第8、10、12、14、16周末，收集各組大鼠（禁食不禁水）的 24h 尿液，備用。末次給藥后，收集各組大鼠新鮮糞便，于 -80^°C 下保存，備用。上述樣品采集完成后，以腹腔注射 2% 戊巴比妥鈉 3mg/kg 麻醉各組大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血樣，備用；取血后，將大鼠處死，摘取其雙腎，取左側(cè)腎臟對(duì)半切開(kāi)后，置于 4% 多聚甲醛溶液中固定，備用。

2.4 尿蛋白含量測(cè)定

取“2.3”項(xiàng)下各組6只大鼠各時(shí)間點(diǎn)的 24h 尿液，采用尿蛋白試劑盒（比色法）檢測(cè) 24h 尿蛋白（24-hoururinetotalprotein， 24h UTP）含量。

2.5 血清Scr、BUN含量測(cè)定

取“2.3\"項(xiàng)下各組6只大鼠的血樣，于室溫下靜置2h后，再于 4^°C 下以 3500r/min 離心 15min ，分離上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清Scr及BUN含量。

2.6 腎組織病理觀(guān)察

取“2.3\"項(xiàng)下各組6只大鼠經(jīng) 4% 多聚甲醛溶液固定48h 的腎組織，修剪至合適大小后置入組織包埋盒中，依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，以 5μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，于 45^°C 溫水中攤片 1～2min ，待切片完全展開(kāi)后用防脫載玻片撈出，于 98^°C 下烤片 20min 后保存，備用。取切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后，依次用蘇木精 .1% 伊紅溶液染色，再以中性樹(shù)膠封片，使用顯微鏡觀(guān)察大鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變，并拍照保存。

2.7 腎小球IgA免疫復(fù)合物沉積情況檢測(cè)

采用免疫熒光法檢測(cè)。取“2.3\"項(xiàng)下各組6只大鼠的腎組織適量，按“2.6\"項(xiàng)下方法制備石蠟切片。取切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，加乙二胺四乙酸進(jìn)行抗原修復(fù)，再以 3%BSA 于 37^°C 下封閉1h;滴加IgA一抗（稀釋度為 1：1 000? ，于 4^°C 下避光孵育過(guò)夜（ （gt;8h ；以PBS洗滌3次，滴加相應(yīng)IgG二抗（稀釋度為1：100），于 37^°C 下避光孵育 2h ;以PBS洗滌3次，再以抗熒光淬滅封片液100μL 封片，使用熒光顯微鏡觀(guān)察并采集圖像，使用ImageJ軟件分析各組大鼠腎小球內(nèi)IgA陽(yáng)性區(qū)域（呈綠色熒光）的熒光強(qiáng)度，用以反映IgA免疫復(fù)合物的沉積情況。

2.8 腸道菌群檢測(cè)

取“2.3\"項(xiàng)下各組6只大鼠的糞便樣本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)吸附柱法純化提取DNA，并擴(kuò)增其16SrRNA ΔV3+V4 可變區(qū)（341F、805R的引物序列分別為5^′ -CCTACGGGNGGCWGCAG- ?3^′?5^′ -GACTACHVGG-GTATCTAATCC- 3^′ ）。取所得PCR產(chǎn)物，構(gòu)建微生物多樣性測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，讀取測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種組成分析和差異微生物分析。上述測(cè)序分析由杭州聯(lián)川生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

其中，Alpha多樣性包括Chao1指數(shù)、Observed spe-cies指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，可反映樣本腸道菌群的物種豐富度信息；Beta多樣性分析包括主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）、主坐標(biāo)分析（principalcoordinateanalysis，PCoA），可反映群落間物種組成的差異；物種組成以相對(duì)豐度為檢測(cè)指標(biāo)，以相對(duì)豐度排前3位的為優(yōu)勢(shì)菌群；通過(guò)組間群落差異（lineardiscriminantanalysiseffect size，LEfSe）分析，以線(xiàn)性判別分析（lineardiscriminantanalysis，LDA）效應(yīng)值（LDA閾值為 3，Plt;0.05 篩選各組大鼠的腸道差異微生物[]。

2.9 外周血免疫平衡指標(biāo)檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下各組3只大鼠的血樣，進(jìn)行抗凝處理。取抗凝全血樣本 200μL ，裂解紅細(xì)胞；收集細(xì)胞，于37°C，5%CO₂ 下培養(yǎng)刺激 ⁴h ；收集細(xì)胞，加入含CD4、CD25抗體的混合液（三者體積分別為 2.5，0.5，2.0μL ），于 4^°C 下避光孵育 20min ，進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記；待破膜后，加入含F(xiàn)OXP3、IL-17A抗體的混合液（體積均為2.5μL 進(jìn)行胞內(nèi)染色；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJoV10軟件分析各組大鼠全血Th17、Treg比例（Th17以CD4、IL-17A標(biāo)記，Treg以CD4、CD25、FOXP3標(biāo)記），并計(jì)算Th17/Treg。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0和GraphPadPrism9.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 M（P_²⁵，P_⁷⁵） 表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunn檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05 。

3結(jié)果

3.1補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠 24h UTP含量的影響

與Normal組相比，Model組大鼠第8、10、12、14、16周的 24h UTP含量均顯著升高（ （Plt;0.05） 。與Model組相比，各藥物組大鼠 24h UTP含量均有所降低，其中BZP組和BQTQ-H組大鼠第12、14、16周以及BQTQ-L組大鼠第14、16周的 24h UTP含量均顯著降低 （Plt; 0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠 UTP含量的影響

a：與Normal組相比， Plt;0.05;b： 與Model組相比， Plt;0.05

3.2補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠血清Scr、BUN含量的影響

與Normal組相比，Model組大鼠血清Scr、BUN含量 均顯著升高 （Plt;0.05） ；與Model組相比，各藥物組大鼠 血清Scr、BUN含量均顯著降低 （Plt;0.05 。結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠血清Scr、BUN含量的影響

a：與Normal組相比， Plt;0.05 ;b：與Model組相比， Plt;0.05

3.3補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠腎組織病理?yè)p傷及IgA免疫復(fù)合物沉積的影響

HE染色結(jié)果顯示，Normal組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞及基質(zhì)均勻分布，未見(jiàn)明顯異常；腎小管上皮細(xì)胞圓潤(rùn)、飽滿(mǎn)，結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)萎縮或擴(kuò)張；腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯增生或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與Normal組相比，Model組大鼠的腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)明顯的系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多；腎間質(zhì)中可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴腎小管萎縮、管腔狹窄閉縮。與Model組相比，各藥物組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增生均有所減輕，腎小球形態(tài)基本正常；腎小管擴(kuò)張程度減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有不同程度減少，未見(jiàn)明顯腎小管萎縮或壞死。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Normal組 （13.84±2.34） 組相比，Model組大鼠腎小球系膜區(qū)、毛細(xì)血管壁IgA陽(yáng)性區(qū)域的熒光強(qiáng)度（ 55.31±6.68 顯著升高 （Plt;0.05） 。與Model組相比，BZP組、BQTQ-L組、BQTQ-H組大鼠腎小球內(nèi)IgA陽(yáng)性區(qū)域有所縮小，其熒光強(qiáng)度 （30.73±3.70，44.30±3.55 、36.94±4.83? 均顯著降低（ （Plt;0.05） 。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.4補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠腸道菌群的影響

3.4.1補(bǔ)氣通竅方對(duì)腸道菌群Alpha多樣性的影響

與Normal組相比，Model組大鼠的Chao1指數(shù)顯著降低 （Plt;0.05 ）。與Model組相比，各藥物組大鼠的Chaol指數(shù)、Observedspecies指數(shù)、Shannon指數(shù)（BZP組除外）、Simpson指數(shù)（BZP組、BQTQ-H組除外）均顯著升高 ?Plt;0.05 ）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠腸道菌群AIpha多樣性的影響 [M（P_²⁵，P_⁷⁵），n=6]

a：與Normal組相比， Plt;0.05：0 與Model組相比， Plt;0.05， 0

3.4.2補(bǔ)氣通竅方對(duì)腸道菌群Beta多樣性的影響

Model組與Normal組、BZP組、BQTQ-L組、BQTQ-H組有所偏離，表明組間微生物組成結(jié)構(gòu)有所差異；此外，BZP組、BQTQ-L組、BQTQ-H組與Normal組有所重疊，提示各藥物組大鼠的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)與Normal組較為相似。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.4.3補(bǔ)氣通竅方對(duì)腸道菌群物種組成的影響

在門(mén)水平（圖3A）上，3種優(yōu)勢(shì)菌群分別為厚壁菌門(mén)Firmicutes、擬桿菌門(mén)Bacteroidota、放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacte-riota。與Normal組相比，Model組大鼠厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度有所升高 （Pgt;0.05 ），而擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低（ Plt;0.05 ；與Model組相比，各藥物組厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度均顯著降低，而擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度均顯著升高 （Plt;0.05） ；各組大鼠放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Pgt;0.05） 。在屬水平（圖3B）上，3種優(yōu)勢(shì)菌群分別為乳桿菌屬Lactobacillus、嗜黏液乳桿菌屬Ligilactobacillus單球菌屬M(fèi)onoglobus;各組大鼠上述菌群相對(duì)豐度相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Pgt;0.05 。

3.4.4補(bǔ)氣通竅方對(duì)腸道差異微生物的影響

LEfSe分析結(jié)果顯示，相較于Normal組，Model組的20種差異微生物包括g_Clostridia_UCG-014_unclassi-fied、o_Clostridia_UCG-014、f_Clostridia_UCG-014_un-classified、s_Clostridia_UCG-014_unclassified等；與Model組相比，BZP組的18種差異微生物包括f_Streptococca-ceae、g_Streptococcus、s_Monoglobus_unclassified等，BQTQ-L組的22種差異微生物包括c_Clostridia、o_Os-cillospirales、o_Bacteroidales等，BQTQ-H組的14種差異微生物包括g_Ruminococcus s Ruminococcus_unclassi-fied、f_Lachnospiraceae等（限于篇幅，相關(guān)結(jié)果可掃描本文首頁(yè)二維碼查看“增強(qiáng)出版\"板塊中的附圖1）。

圖2補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠腸道菌群Beta多樣性的影響

3.5補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠外周血免疫指標(biāo)的影響

與Normal組相比，Model組大鼠外周血Th17比例、Th17/Treg均顯著升高，Treg比例顯著降低 （Plt;0.05 。與Model組相比，各藥物組大鼠外周血Th17比例、Th17/Treg均顯著降低，Treg比例均顯著升高 （Plt;0.05 。結(jié)果見(jiàn)表4（限于篇幅，相關(guān)流式圖可掃描本文首頁(yè)二維碼查看“增強(qiáng)出版”板塊中的附圖2）。

4討論

中醫(yī)學(xué)并無(wú)“IgAN\"這一病名，但可據(jù)其臨床表現(xiàn)劃為“水腫”“尿血”“尿濁\"等范疇，若病情加重還可將其劃入“癃閉\"“關(guān)格”\"虛勞\"等范疇[2。該癥病機(jī)責(zé)之于正虛邪盛，其中關(guān)鍵病因在于濕熱濁邪，侵襲肺脾胃，繼而損及腎臟，與肺、脾、腎功能失調(diào)相關(guān)[13]。AR是一種由IgE介導(dǎo)的慢性鼻部炎癥性疾病，屬“鼻軌\"范疇，多由臟腑虛損、正氣虧虛所致，其中脾腎虛弱、肺氣不足、衛(wèi)表不固為發(fā)病之關(guān)鍵[14。由此可見(jiàn)，二者的發(fā)病過(guò)程均與肺脾腎臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)，有“異病同治”之基礎(chǔ)

補(bǔ)氣通竅方是由黃芪、黨參等11味中藥組方而成的經(jīng)驗(yàn)方，可用于AR的治療。方中，黃芪可補(bǔ)脾益氣、固表升陽(yáng)，為君藥；黨參可健脾益肺，以助黃芪益氣扶正；佐以細(xì)辛引藥入腎，驅(qū)散腎中風(fēng)寒；荊芥、桔梗、魚(yú)腦石可清熱解毒，散結(jié)排濁；升麻、柴胡可升陽(yáng)舉陷，助黃芪、黨參固護(hù)中氣；蒼耳子、辛夷可祛風(fēng)除濕通絡(luò)；佐以甘草調(diào)和諸藥；諸藥合用，共奏益氣固表、扶正祛邪之功。

本研究從“異病同治\"理論出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建IgAN大鼠模型探析補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN的干預(yù)效果，結(jié)果顯示，與模型組相比，補(bǔ)氣通竅方降低了IgAN大鼠血清Scr、BUN含量。本研究還通過(guò)檢測(cè) 24h UTP含量來(lái)評(píng)估了補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠疾病進(jìn)展的影響，結(jié)果顯示，自第12周起，高劑量的補(bǔ)氣通竅方可有效減少大鼠尿蛋白的漏出；第14、16周，各劑量組大鼠 24h UTP含量均顯著低于Model組，進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN的改善作用。病理?yè)p傷改善是評(píng)估IgAN治療效果的另一項(xiàng)重要指標(biāo)，本研究的HE染色結(jié)果顯示，補(bǔ)氣通竅方各劑量組大鼠的腎小球系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增生均有所減輕，腎小管萎縮和擴(kuò)張程度均有所降低，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，表明該方能顯著緩解IgAN引起的腎臟病理?yè)p傷。研究指出，IgA免疫復(fù)合物可通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)來(lái)引發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化和腎功能衰竭。本研究的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)氣通竅方可顯著減少I(mǎi)gAN大鼠腎小球內(nèi)的IgA免疫復(fù)合物沉積，從而減輕腎臟的免疫損傷、延緩疾病進(jìn)展。

IgAN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腸道菌群失調(diào)與Th17/Treg免疫失衡在IgAN的發(fā)生過(guò)程中具有協(xié)同作用，二者可通過(guò)復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來(lái)共同促進(jìn)疾病的進(jìn)展[]。IgA免疫復(fù)合物在腎小球系膜中的沉積是IgAN的顯著標(biāo)志，當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，致病菌或其代謝產(chǎn)物可通過(guò)破壞腸道屏障而侵入循環(huán)系統(tǒng)，激活腸道黏膜的異常免疫反應(yīng)，致使 CD4⁺ T細(xì)胞失調(diào)[5]。Th17和Treg均來(lái)源于CD4⁺ T細(xì)胞，腸道黏膜的異常免疫反應(yīng)可進(jìn)一步成為T(mén)h17/Treg免疫失衡的驅(qū)動(dòng)因素：其中，Th17的過(guò)度分化可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，加重中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增生及纖維化；而Treg則通過(guò)分泌IL-10和表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4來(lái)抑制免疫反應(yīng)，從而阻止 CD4⁺ T淋巴細(xì)胞向Th17分化[1]。IgAN患者通常表現(xiàn)出Th17比例升高、Treg數(shù)量減少；此外，IgAN模型小鼠也同樣表現(xiàn)出Th17/Treg比例失衡及Th17極化，表明Th17/Treg免疫失衡可能參與了IgAN的發(fā)生發(fā)展[17-18]

為深入探索補(bǔ)氣通竅方干預(yù)IgAN的潛在機(jī)制，本研究進(jìn)一步通過(guò)16SrRNA測(cè)序和流式細(xì)胞術(shù)探討了該方對(duì)IgAN大鼠腸道菌群及外周血Th17/Treg免疫平衡的影響。結(jié)果顯示，IgAN大鼠腸道菌群物種豐富度、均勻度均有所降低，且其物種組成與Normal組大鼠具有明顯差異；經(jīng)補(bǔ)氣通竅方干預(yù)后，大鼠的腸道菌群物種豐富度、均勻度均明顯改善，補(bǔ)氣通竅方各劑量組大鼠腸道菌群物種組成與Normal組大鼠較為相似，提示該方對(duì)IgAN大鼠的腸道菌群穩(wěn)態(tài)有一定的正向調(diào)控作用，進(jìn)而影響IgAN的病理進(jìn)程。在門(mén)水平上，補(bǔ)氣通竅方各劑量組大鼠厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度均較Model組顯著降低，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度均較Model組顯著升高。研究指出，擬桿菌門(mén)是腸道微生物群中的關(guān)鍵生產(chǎn)者，能夠?qū)⒉豢上奶妓衔锓纸獬啥替溨舅幔⊿hort-chainfattyacids，SCFAs），而IgAN大鼠體內(nèi)擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度的降低可能導(dǎo)致SCFAs等有益代謝產(chǎn)物減少，從而抑制Treg細(xì)胞的活化[]。進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了這一可能，即IgAN大鼠外周血中Th17比例、Th17/Treg均較Normal組顯著升高，Treg比例則較Normal組顯著降低；而補(bǔ)氣通竅方可顯著逆轉(zhuǎn)上述免疫平衡指標(biāo)的改變。

在IgAN發(fā)生發(fā)展中，Th17的異?；罨纱龠M(jìn)炎癥因子的分泌，加劇腎臟的免疫病理?yè)p傷，同時(shí)Treg的減少則無(wú)法有效遏制這種異常免疫反應(yīng)[20。本課題組前期研究結(jié)果顯示，補(bǔ)氣通竅方可通過(guò)調(diào)控AR大鼠Th17/Treg平衡來(lái)緩解炎癥損傷，從而減輕鼻黏膜的炎癥反應(yīng)，緩解鼻部癥狀。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)氣通竅方可顯著降低IgAN大鼠外周血Th17比例和Treg/Th17，顯著升高Treg比例，減少腎小球IgA免疫復(fù)合物的沉積，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。這種對(duì)Th17/Treg免疫平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制使得補(bǔ)氣通竅方能夠同時(shí)治療AR和IgAN，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)\"異病同治”。

綜上所述，補(bǔ)氣通竅方能夠有效改善IgAN大鼠腎功能，降低腎小球中IgA免疫復(fù)合物的沉積，減輕腎組織病理?yè)p傷，調(diào)節(jié)腸道菌群物種組成及豐富度，維持Th17/Treg免疫平衡，即該方可能通過(guò)調(diào)控腸道菌群穩(wěn)態(tài)和Th17/Treg免疫平衡來(lái)發(fā)揮對(duì)IgAN大鼠的腎臟保護(hù)作用；其中該方對(duì)Th17/Treg免疫平衡的調(diào)節(jié)可能是補(bǔ)氣通竅方“異病同治\"的科學(xué)內(nèi)涵。然而，本研究也存在一定的局限性，如尚未進(jìn)一步評(píng)估補(bǔ)氣通竅方對(duì)IgAN大鼠腸道屏障功能的影響，其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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