熊果酸對變應性接觸性皮炎模型大鼠的改善作用及機制

中圖分類號 R965;R285.5 文獻標志碼A 文章編號1001-0408（2025）20-2537-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.20.09

Improvement effect and mechanism of ursolic acid on allergic contact dermatitis model rats

YANG Yang， ZHANG Ying，LIU Tian，PENG Leilei，PAN Yun（Dept. of Dermatology，Wuhan Sixth HospitalWuhan ，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigate theameliorativeefectofursolicacidonskininflammationinratswithalergiccontact dermatitis（ACD），and exploreitsmechanism of actionbasedonthe Notchl/hairyandenhancerof split1（Hesl）signaling pathway.METHODS TheACDmodel wasestablished byskinapplicationof2，4-dinitrochlorobenzene.Fortysuccesfullymodeled rats were randomly divided into model control group （MC group），ursolic acid low-dose group （UA-L group， 50mg/kg ），ursolic acid high-dose group （UA-H group， 100mg/kg ），and ursolic acid high-dose + Notchl activator group（UA- ?H+ Jaggedl group，100 mg/kg ursolic acid +50ng/kg Jagged1），with 1O rats in each group.Another 1O rats with only hair shedding were selected as the normalcontrolgroup.Ratsintheadministrationgroupsweregiventhecorespondingdoseofursolicacidintragastricallyor/and Jagged1byintraperitonealinjectiononceadayfor14consecutivedays.Twenty-four hoursaferthelasttreatment，theskin inflammationstatusanddermatitisscoresofratsineachgroup weredetected.Thelevelsofinterleukin-6（IL-6），IL-17andIL-10 inserumandskin tisueweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay.Hematoxylin-eosinstainingwasused todetectthe pathologicalmorphologyof teskintisue.Immunohistochemicalstainingndimmunoblotingasaywereusedtodetecttherotein expressions of Notch1and Hesl inskintisues.RESULTSCompared with the MCgroup，both the UA-L groupand UA-Hgroup exhibitedsignificantlylowerdermatitisscores，alongwithvaryingdegresofreductioninhistopathologicalskindamagesuchas inflammatorycellinfiltrationAdditionally，thelevelsofIL-6andIL-7inserumandskintisuesweremarkedlyecreased，hile thelevelsofIL-10weresignificantlyincreased inbothgroups；proteinexpressonsofNotchlandHeslweredecreasedsignificantly 1 （Plt;0.05 ），and the improvements in the aforementioned indicators were more significant in the UA-H group （ （Plt;0.05） ）.Jagged1 could significantly weaken the improvement effects of UA-H on the above indicators （ Plt;0.05 .CONCLUSIONS Ursolic acid mayatenuatetheexpressionofpro-inflammatorycytokinesandenhancetheexpressionofanti-inflammatoryfactorsbyblocking Notchl/Hesl signaling pathway，thereby improving dermatitis symptoms in ACD rats.

KEYWORDS ursolic acid;allergic contact dermatitis；Notch1/Hes1 signaling pathway

變應性接觸性皮炎（allergiccontactdermatitis，ACD）是一種常見的炎癥性皮膚病。研究指出，T淋巴細胞異常激活導致的免疫炎癥反應是誘發ACD的主要機制，白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10等炎癥因子在此過程中發揮了關鍵的調控作用，故抗炎是臨床治療ACD的有效方法。熊果酸是一種天然三萜羧酸化合物，具有抗炎活性，可通過減少活性氧、促炎性細胞因子生成來抑制免疫炎癥。已有研究報道，熊果酸能夠通過改善炎癥反應和氧化應激來減輕特應性皮炎小鼠的皮炎癥狀[。但該成分在ACD領域的研究有限，分子機制也未闡明。Notchl/毛狀分裂增強子1（hairyanden-hancerofsplit1，Hes1）信號通路能夠促進活性氧及炎癥因子的產生；阻斷該通路可調控T淋巴細胞的活化及分化，減輕機體免疫炎癥反應，從而改善銀屑病小鼠的皮膚炎癥4；上調該通路則可加重接觸性皮炎的相關癥狀。此外，有研究證實，熊果酸可通過抑制該通路來改善糖尿病腎病足細胞的有絲分裂障礙[。由此本課題組推測，熊果酸可能通過調控Notch1/Hes1信號通路來影響ACD的疾病進展。為了驗證上述推測，本研究基于Notch1/Hes1信號通路，初步探索熊果酸對ACD大鼠血清、皮膚組織中炎癥因子的影響及對皮膚炎癥的改善作用，旨在為ACD的臨床治療提供參考。

1材料

1.1 主要儀器

MultiskanFC型酶標儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Mini-PROTEAN型蛋白電泳系統、Chemi-DocTMXRS型凝膠成像系統、Trans-BlotTurbo全能型蛋白轉印系統均購自美國Bio-Rad公司；RM2245型病理切片機、HistoCoreArcadia型石蠟包埋機、DM4000BLED型生物顯微鏡均購自德國Leica公司。

1.2 主要藥品與試劑

熊果酸對照品（批號110742-201622，純度 ?98% ）購自南京森貝伽生物科技有限公司；Notch1激動劑Jaggedl的對照品（批號188-204，純度 99.39% 購自美國MedChem-Express公司；2，4-二硝基氯苯（DNCB，批號138630）購自上海北諾生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA法總蛋白定量試劑盒、高強度RIPA裂解液（批號分別為D006-1-1、A045-4-2、W062-1-1）均購自南京建成生物工程研究所；大鼠IL-6、IL-10酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，兔抗Notch1 B -肌動蛋白（ β. -actin）Hes1抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號分別為ab234570、ab214566、ab27526、ab8227、ab108937、ab6721）均購自英國Abcam公司；大鼠IL-17ELISA試劑盒（批號JL20879-48T）購自江萊生物科技有限公司；HRP免疫組織化學試劑盒（批號E670018）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠，SPF級，體重 210～235g，6～7 周齡，由湖北貝恩特生物科技有限公司提供，生產許可證號為SCXK（鄂）2021-0027。所有大鼠均在通風良好的屏障環境（溫度 23～25^°C， 相對濕度 50%～60%.12h 明暗交替的動物房）內分籠飼養，并自由攝食、飲水。本實驗經湖北貝恩特生物科技有限公司動物倫理委員會批準（批準號BNT-2022-1169）。

2 方法

2.1 造模

按相關文獻方法建立ACD大鼠模型：SD大鼠適應性喂養1周后，在背部選擇2處脫毛區域，分別為靠近頭部的 2cm×3 cm區域及靠近尾部的 4cm×4cm 區域。首先，在靠近頭部的脫毛區域（致敏區）單次涂抹含7% DNCB的丙酮溶液進行致敏，2周后在靠近尾部的脫毛區域（激發區）單次涂抹含 0.1%DNCB 的丙酮溶液進行激發。當大鼠背部激發區皮膚出現丘疹、明顯腫脹及紅斑，并伴有煩躁不安和搔抓行為時，表明ACD大鼠模型構建成功。

2.2 分組與給藥

將建模成功的40只大鼠隨機分為模型組（MC組）、熊果酸低劑量組（UA-L組）熊果酸高劑量組（UA-H組）和熊果酸高劑量+Notch1激動劑組（UA- ?H+ Jagged1組），每組10只。另選10只背部僅有2處脫毛區域的正常大鼠作為正常對照組（NC組）。UA-L組和UA-H組大鼠分別按 50，100mg/kg 的劑量灌胃熊果酸藥液（溶劑為生理鹽水），同時按 10mL/kg 的量腹腔注射生理鹽水；UA-H+ Jaggedl組大鼠按 50ng/kg 的劑量腹腔注射Jaggedl藥液（溶劑為生理鹽水） 2h 后，再按 100mg/kg 的劑量灌胃熊果酸藥液；MC組和NC組大鼠灌胃并腹腔注射等體積生理鹽水。各組大鼠每天干預1次，連續 14d

2.3 大鼠皮炎評分

末次給藥后 24h ，觀察各組大鼠的皮膚炎癥狀態，并采用雙盲法對其背部皮膚進行皮炎評分。該評分涉及4個項目，分別為紅斑/出血、干燥/結痂、水腫、潰爛/表皮脫落；每個項目根據嚴重程度分為嚴重、中度、輕度、無癥狀4個等級，分別記3、2、1、0分；各項評分的總和即為皮炎評分[10]

2.4大鼠標本采集

皮炎評分結束后，以乙醚吸入麻醉各組大鼠，斷尾采血。血樣于 4^°C 下以 448×g 離心 15min ，取上清液（血清），于 -80^°C 下保存，備用。然后，剪下大鼠靠近尾部脫毛區域的皮膚組織，精密稱取 0.4g ，加人生理鹽水研磨，于 4^°C 下 1000×g 離心 20min ，吸取上清液，即得皮膚組織樣品液，于 ?-80^°C 下保存，備用；另取該區域皮膚組織約 0.4g ，于液氮中凍存，備用；取該區域剩余皮膚組織，固定在 10% 甲醛溶液中，備用。

2.5大鼠血清及皮膚組織中炎癥因子水平的檢測

取“2.4\"項下各組大鼠的血清及皮膚組織樣品液適量，按ELISA試劑盒說明書操作，以酶標儀檢測其中IL6、IL-17、IL-10水平。

2.6大鼠皮膚組織病理形態學觀察

取“2.4\"項下在 10% 甲醛溶液中固定的各組大鼠皮膚組織，以乙醇梯度脫水、石蠟包埋后連續切片；切片經二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化、清洗后進行HE染色，使用生物顯微鏡觀察各組大鼠皮膚組織的病理形態。

2.7大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白表達的檢測

2.7.1 免疫組化法

取“2.6\"項下各組大鼠的皮膚組織切片，經脫蠟、水化后以 5% 牛血清白蛋白封閉，分別加入Notch1、Hes1一抗（稀釋比例均為1：100）， 4°C 孵育過夜；洗片后，以

HRP免疫組織化學試劑盒孵育相應二抗（稀釋比例為1：1000）， 37^°C 孵育 30min ；再以 3，3^′ -二氨基聯苯胺（DAB）染色，在生物顯微鏡下觀察各組大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白的陽性表達（呈棕色）情況，使用ImageJ軟件定量分析兩者的吸光度，并按下式計算其相對陽性表達量：相對陽性表達量 實驗組蛋白吸光度NC組蛋白吸光度。

2.7.2 免疫印跡法

取“2.4\"項下各組大鼠凍存的皮膚組織，加入RIPA裂解液，研磨，于 4^°C 下以 1000×g 離心 20min ，提取總蛋白；以BCA法測定蛋白濃度，再用沸水浴進行變性處理。取變性蛋白適量，經電泳分離、轉膜后，以 3% 牛血清白蛋白封閉;分別加入Notchl、Hes1 ??β -actin一抗（稀釋比例分別為 ）， 4^°C 孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1：10000），室溫孵育1h;洗膜后，以化學發光試劑顯色、成像。使用ImageJ軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以目的蛋白與內參蛋白 _β -actin）的灰度值比值作為目的蛋白的表達量。

2.8 統計學方法

采用SPSS24.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α=0.05 。

3結果

3.1 各組大鼠皮炎評分比較

NC組、MC組、UA-L組、UA-H組和UA-H+Jagged1組大鼠的皮炎評分分別為0、 6.30±0.60 、 4.50± 0.40）、 （2.80±0.20） 、 （6.10±0.50） 分（ n=10 。與NC組比較，MC組大鼠激發區皮膚出現丘疹、明顯腫脹及紅斑，并伴有煩躁不安和搔抓行為，皮炎評分顯著升高L （Plt;0.05） ；與MC組比較，UA-L組和UA-H組大鼠上述癥狀均有不同程度減輕，皮炎評分均顯著降低 （Plt;0.05） ；與UA-L組比較，UA-H組大鼠皮炎評分顯著降低（ Plt; 0.05）；與UA-H組比較，UA-H+Jagged1組大鼠上述癥狀明顯加重，皮炎評分顯著升高 （Plt;0.05 ）。結果見圖1。

圖1各組大鼠皮膚狀態的觀察圖

3.2各組大鼠血清及皮膚組織中炎癥因子水平比較

與NC組比較，MC組大鼠血清及皮膚組織中IL-6、IL-17水平均顯著升高，IL-10水平均顯著降低（ Plt;0.05）;與MC組比較，UA-L組和UA-H組大鼠血清及皮膚組織中IL-6、IL-17水平均顯著降低，IL-10水平均顯著升高 （Plt;0.05） ；與UA-L組比較，UA-H組大鼠血清及皮膚組織中IL-6、IL-17水平均顯著降低，IL-10水平顯著升高 （Plt;0.05） ；與UA-H組比較，UA-H+Jagged1組大鼠血清及皮膚組織中IL-6、IL-17水平均顯著升高，IL-10水平均顯著降低 （Plt;0.05 ）。結果見圖2。

I：NC組;II：MC組;II：UA-L組;IV：UA-H組;V：UA- ?H+ Jagged1 組；a：與NC組比較， Plt;0.05 ；b：與MC組比較， ?Plt;0.05 ;c：與UA-L組比 較 Plt;0.05 ;d：與UA-H組比較， Plt;0.05，

圖2各組大鼠血清及皮膚組織中炎癥因子水平比較

3.3各組大鼠皮膚組織病理形態比較

NC組大鼠皮膚組織形態正常，無病理損傷；MC組大鼠皮膚組織存在嚴重病理損傷，表現為表皮結痂壞死、真皮層損傷嚴重，并可見大量炎癥細胞浸潤并累及皮下組織；與MC組比較，UA-L組和UA-H組大鼠皮膚組織病理損傷均有不同程度減輕，且UA-H組大鼠皮膚組織病理損傷的改善更明顯；與UA-H組比較，UA ?H+ Jagged1組大鼠皮膚組織病理損傷加重。結果見圖3。

3.4各組大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白表達比較

與NC組比較，MC組大鼠皮膚組織中Notch1、Hes1蛋白的表達均顯著上調（ Plt;0.05 ）;與MC組比較，UA-L組和UA-H組大鼠皮膚組織中Notch1、Hes1蛋白的表達均顯著下調（ Plt;0.05 ）;與UA-L組比較，UA-H組大鼠皮膚組織中Notch1、Hes1蛋白的表達均顯著下調（ Plt; 0.05）;與UA-H組比較，UA-H+Jagged1組大鼠皮膚組織中Notch1、Hes1蛋白的表達均顯著上調 （Plt;0.05 。免疫組化法結果見圖4和圖5，免疫印跡法結果見圖6和圖7。

黑色箭頭：表皮；紅色箭頭：炎癥細胞。

圖3各組大鼠皮膚組織病理形態學觀察的顯微圖（HE染色）

4討論

ACD是皮膚科常見病、多發病。當機體反復接觸過敏原時，炎癥部位會釋放促炎性細胞因子（如IL-6、IL-17），同時抗炎細胞因子IL-10分泌會減少，從而引發ACD^[11-12] 。本研究結果顯示，與NC組比較，MC組大鼠血清及皮膚組織中IL-6、IL-17大量產生，而IL-10水平顯著降低；大鼠激發區皮膚出現丘疹、明顯腫脹及紅斑，并伴有煩躁不安和搔抓行為，皮炎評分顯著升高；皮膚表皮出現結痂壞死、真皮層損傷嚴重、大量炎癥細胞浸潤并累及皮下組織。這表明ACD大鼠模型構建成功。

本研究采用灌胃方式給予熊果酸，是基于疾病全身性免疫病理特征的科學考量。雖然，熊果酸存在水溶性差、口服生物利用度低的不足，但通過制劑技術（如使用增溶劑，或將其制備成納米乳、脂質體等劑型）可顯著改善其胃腸吸收特性。ACD本質上是由T淋巴細胞介導的全身免疫異常，局部用藥難以全面調控系統性免疫失衡，而灌胃給藥可使藥物經吸收后系統性地作用于免疫細胞，從源頭抑制促炎性細胞因子釋放，實現對皮膚炎癥的有效控制[13；此外，灌胃給藥具有劑量準確、操作簡便、對動物損傷小等優勢，可避免局部給藥時因動物舔舐、皮膚吸收不均所造成的誤差。這種給藥方式適用于ACD模型的藥效學評價，可與臨床實際應用需求相銜接，從而為后續相關口服制劑的開發提供可靠數據。

T淋巴細胞亞群功能失衡引發的細胞因子分泌紊亂可引發嚴重的免疫炎癥反應。這種免疫炎癥反應是造成皮膚炎癥損傷，最終導致ACD發生的主要作用機制，而抑制炎癥則可有效改善ACD的相關癥狀[14]。熊果酸提取自連錢草、越橘、熊果樹等植物，可通過抑制免疫炎癥反應來改善類風濕關節炎相關癥狀。本研究以高、低劑量熊果酸干預ACD大鼠，結果顯示，熊果酸可顯著降低模型大鼠血清及皮膚組織中IL-6、IL-17水平，顯著

圖4各組大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白表達的免疫組化圖

a：與NC組比較， Plt;0.05：6 ：與MC組比較， Plt;0.05 ;c：與UA-L組 比較， ：與UA-H組比較， Plt;0.05， 0

圖5各組大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白表達的免疫組化法結果比較""）

圖6各組大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白表達的電泳圖

a：與NC組比較， Plt;0.05 ；b：與MC組比較， Plt;0.05 ;c：與UA-L組 比較， Plt;0.05 ;d：與UA-H組比較， Plt;0.05 O

圖7各組大鼠皮膚組織中Notch1和Hes1蛋白表達的免疫印跡法結果比較""）

升高IL-10水平，減輕其皮膚組織病理損傷并降低皮炎評分，且高劑量熊果酸的作用更明顯，提示該成分可通過減輕炎癥來改善ACD大鼠的皮炎癥狀，具有一定的開發利用價值。

Notch1/Hes1是機體調控T淋巴細胞亞群功能及免疫炎癥的重要信號通路，抑制其激活可減輕免疫炎癥，從而改善銀屑病小鼠的皮膚癥狀4。本研究結果顯示，高、低劑量熊果酸能顯著下調ACD大鼠皮膚組織中Notch1、Hes1蛋白的表達，且高劑量熊果酸的作用更明顯；此外，Notch1激活劑Jagged1能顯著減弱高劑量熊果酸對ACD大鼠炎癥反應的改善作用，提示熊果酸改善ACD大鼠的炎癥反應可能是通過抑制Notch1/Hes1信號通路來實現的。

本研究存在以下不足：僅檢測了3種炎癥因子（IL-6、IL-17、IL-1O），未覆蓋Th2及T細胞通路；Jagged1未能完全逆轉熊果酸的改善作用，且缺乏單獨的Jaggedl組和Notch1抑制劑組；未深入探究熊果酸對T細胞異常激活及Notch1/Hes1信號通路的影響；未對熊果酸最佳劑量、作用優勢及毒性、屏障功能進行評估。后續將開展mRNA測序，驗證Jagged1獨立作用及Notch1作用機制；聚焦T細胞與Notch1/Hes1信號通路，篩選最佳劑量；結合多組學（如脂質組學 + 轉錄組學）技術分析屏障-免疫相互作用，并補充毒理學評估。

綜上所述，熊果酸可能通過抑制Notch1/Hes1信號通路來減弱促炎性細胞因子表達并增強抗炎細胞因子表達，從而改善ACD大鼠的皮炎癥狀。

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