原花青素對兔激素性股骨頭壞死的改善作用及機制研究

摘要目的基于受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）/RIPK3/混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）信號通路，研究原花青素（PACs）對兔激素性股骨頭壞死（SONFH）的改善作用及機制。方法采用注射大腸桿菌內毒素 + 甲潑尼龍的方法復制SONFH模型兔。將造模成功的兔隨機分為模型組（Model組，生理鹽水）、PACs低劑量組（PACs-L組， 11mg/kg ）、PACs高劑量組（PACs-H組，22mg/kg ）、PACs高劑量+RIPK1激活劑（RIPK1重組蛋白，簡稱“rRIPK1\"）組（PACs-H+rRIPK1組， 22mg/kgPACs+4μg/kg rRIPK1），另設置對照組（Control組，生理鹽水），每組6只。各藥物組免每天灌胃/注射相應藥液1次，持續干預4周。末次給藥后，檢測兔血清中腫瘤壞死因子 ）、白細胞介素6（IL-6）含量;檢測兔股骨微結構[骨密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）變化;觀察兔股骨組織的病理學形態;檢測免股骨組織細胞凋亡情況；檢測兔股骨組織中血管內皮生長因子（VEGF）、骨形態發生蛋白2（BMP2）mRNA的表達水平;檢測免股骨組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白的表達水平。結果與Control組比較，Model組兔血清中TNF- ?α_⊥IL-6 含量和Tb.Sp、空骨陷窩率、細胞凋亡率以及股骨組織中RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白的磷酸化水平均顯著升高 ?Plt;0.05 ；BMD、Tb.Th、Tb.N，股骨組織中VEGF、BMP2mRNA的表達水平以及胱天蛋白酶8（caspase-8）的表達水平均顯著降低 ?Plt;0.05 ）；股骨組織中骨細胞分布不均，骨小梁排列稀疏。與Model組比較，PACs各劑量組上述定量指標（ Plt;0.05 ）和病理變化均顯著改善。與PACs-H組比較，PACs-H+rRIPK1組上述定量指標（ Plt; 0.05）和病理變化均顯著逆轉。結論 PACs可改善兔SONFH，其作用機制可能與抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路激活、抑制股骨組織細胞凋亡、促進血管新生有關。

吳春立1*，劉利婷2，趙旭婷2，孫瑞芬2，王文選3”（1.內蒙古醫科大學第二附屬醫院血管外科，呼和浩特；2.內蒙古醫科大學第二附屬醫院骨科，呼和浩特;3. ）

中圖分類號 R966;R681.8 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）20-2519-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.20.06

Study on the improvement efects and mechanism of proanthocyanidins on steroid-induced osteonecrosis of thefemoral headinrabbits

WU Chunli'，LIU Liting2，ZHAO Xuting2，SUN Ruifen2，WANG Wenxuan3（1. Dept. of Vascular Surgery，the Second Afiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot O100l0，China；2.Dept.of Orthopedics，the Second Afiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot O100l0，China; 3.Area A，Trauma Surgery Center，the Second Afiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot ，China）

ABSTRACTOBJECTIVETo studytheimprovement effectsand mechanismof proanthocyanidins（PACs）onsteroid-inducedosteonecrosisofthefemoralhead（SONFH）inabitsbasedonthereceptor-interactingproteinkinase1（RIPK1）/RIPK3/mixedlineagekinasedomain-likeprotein（MLKL）signalingpathway.METHODSSONFH model inrabitswas induced byinjectingEscherichiacoliendotoxin+methylprednisolone.ThesucessullymodeledrabitswererandomlydividedintoModelgroup（omalsaline），low-dose PACs group （PACs-L group， 11mg/kg ），high-dose PACs group（PACs-H group， 22mg/kg ），high-dose PACs⁺ RIPK1 activator（rRIPK1） group （PACs-H+rRIPK1 group， 22mg/kgPACs+4μg/kg rRIPK1），along with a control group （normalsaline），with6rabitsineachgroup.Eachadministrationgroupwasgivenrelevant medicineonceadayintragastricall/viainjection，for 4 consecutive weeks.After the last administration，the levels of tumor necrosis factor- α （TNF- α ）andinterleukin-6（IL-6）irabbit serumwere measured.Thechanges inthemicrostructureofrabbit femurs，includingbone mineraldensity（BMD），

trabecularthickness（Tb.Th），trabecularnumber（Tb.N），and trabecularseparation（Tb. Sp） wereexamined.The histopathological features of rabbit femoral tissueswere observed，and the apoptotic status of cells within the rabbit femoral tissues was detected.The mRNA expressionsof vascularendothelialgrowthfactor（VEGF）andbone

morphogeneticprotein 2（BMP2）inrabit femoral tissues were determined.Theexpresionsof RIPK1/RIPK3/MLKLsignaling pathway-related proteinsin femoral tisses weredetected.RESULTSComparedwiththe Control group，serumcontentsof TNF- α （2 and IL-6，Tb.Sp，emptybone cavityrate，cellapoptosisrate，phosphorylation levelsof RIPK1，RIPK3 and MLKLinfemoral tissue were significantly increased in the Model group （ ΔPlt;0.05 ）.BMD，Tb.Th，Tb.N，as wellas the mRNA expression of VEGF and BMP2，along with protein expression of caspase-8，in the femoral tissues were all decreased（ Plt;0.05 ）.The bone cells in the femoraltissue wereunevenlydistributed，andthetrabeculae werearrangedsparsely.Comparedwith the Model group，the aforementioned quantitative indicators（ ΔPlt;0.05 ）and pathological changes in all dosage groups of PACs showed significant improvements. Compared with the PACs-H group，the aforementioned quantitative indicators （ （Plt;0.05 ）and pathological changes in the PACs-H+rRIPK1 group showed significant reversal.CONCLUSIONS PACscanameliorate SONFH inrabits，andits mechanismof action mayberelated tothe inhibitionof theactivationoftheRIPKl/RIPK3/MLKL signaling pathway，suppresson of apoptosis in femoral tissue cells，and promotion of angiogenesis.

KEYWORDSproanthocyanidins；steroid-inducedosteonecrosisof the femoral head；RIPK1/RIPK3/MLKL signalingpathway; angiogenesis

股骨頭壞死是一種難治性骨科疾病，其中由激素（如類固醇）誘導的股骨頭壞死[即激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是非創傷性股骨頭壞死最常見的類型，以骨細胞缺血、壞死，骨小梁骨折，股骨頭塌陷和關節功能障礙為主要特征[-2]。目前，針對SONFH的治療藥物存在一定副作用，如雙麟酸鹽可能導致頜骨壞死、抗凝藥物可增加出血風險[。因此，尋找新的SONFH治療藥物具有重要意義。

原花青素（proanthocyanidins，PACs）是一大類多酚類化合物的總稱，具有抗炎、抗凋亡等藥理活性。相關體外研究顯示，PACs可抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡，具有改善股骨頭壞死的潛力，但具體作用機制有待進一步完善4。壞死是一種細胞程序性死亡方式，由受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interactingprotein ki-nase1，RIPK1）/RIPK3/混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixedlineagekinasedomain-likeprotein，MLKL）信號通路介導[5。研究表明，糖皮質激素可通過促進RIPK1、RIPK3表達而激活細胞程序性死亡途徑，從而加劇大鼠股骨頭壞死。然而，PACs是否可通過調控RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路來改善SONFH尚不明確。基于此，本研究擬基于RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路，通過構建SONFH模型兔來探究PACs對SONFH的改善作用及機制，以期為臨床治療SONFH提供參考。

1材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括QuantumGX型小動物Micro-CT影像系統（德國PerkinElmer公司）、800TS型酶標儀（廣州儀新生物科技有限公司）Leica型光學顯微鏡[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司]、CX41-32RFL型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）AlphaImagerHP型凝膠成像系統（美國ProteinSimple公司）QuantStudio 5型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）等。

1.2主要藥品與試劑

PACs原料藥（批號P413229）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RIPK1激活劑[RIPK1重組蛋白（簡稱\"rRIPK1\"）；批號HY-I2479，純度 ?98%] 購自美國MedChemExpress公司；大腸桿菌內毒素（批號8000P）購自上海雅吉生物科技有限公司；甲潑尼龍（批號A35511）購自上海維亦特生物科技有限公司；青霉素鈉（批號A2638）購自北京康瑞納生物科技有限公司；反轉錄試劑盒（批號AK3495）購自浙江麥飛生物科技有限公司；腫瘤壞死因子 ∝ （tumor necrosis factor ??α∝ ，TNF-α）白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為10268、20187）均購自上海江萊生物科技有限公司;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20087CR）購自上海碧云天生物技術有限公司；TUNEL試劑盒（批號0003）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔抗磷酸化RIPK1（phosphorylatedRIPK1，p-RIPK1）、RIPK1、磷酸化RIPK3（phosphory-latedRIPK3，p-RIPK3）、RIPK3、磷酸化MLKL（phosphorylated-MLKL，p-MLKL）、MLKL、胱天蛋白酶8（caspase-8）甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號分別為ab316924、ab300617、ab284393、ab316957、ab196436、ab184718、ab247233、ab181602）均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（貨號FNSA-0004）購自武漢菲恩生物科技有限公司；血管內皮生長因子（vascularendo-thelialgrowthfactor，VEGF）、骨形態發生蛋白2（bonemorphogenetic protein 2，BMP2） ??β -肌動蛋白（ β -actin）的mRNA擴增引物由北京擎科生物科技有限公司設計并合成，具體信息見表1。

表1PCR引物序列及擴增產物長度

1.3實驗動物

本研究所用動物為3月齡新西蘭兔，共36只，體重約 2.3～2.5kg ，由內蒙古大學提供，動物生產許可證號為SCXK（蒙）2020-0006。兔飼養環境溫度為 20～ 24^°C ，相對濕度為 40%～60% ，自由活動、采食。本實驗經內蒙古大學生命科學學院動物倫理委員會批準（批準文號IMU-2024-mouse-080）。

2 方法

2.1 造模與分組

將兔適應性喂養7d后，隨機選取27只作為造模組，按下述方法造模：于兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內毒素（ 10μg/kg） ， 24h 后再次注射1次；隨后于臀中肌注射甲潑尼龍 20mg/kg ，每隔 24h 注射1次，共注射3次；另外，每周肌內注射青霉素鈉（5萬單位/kg）2次，預防感染。另取9只兔，以生理鹽水代替藥物，作為對照組（Control組）。5周后，從造模組和Control組中分別選取3只兔，采用Micro-CT影像系統檢測其股骨骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb.Th）、骨小梁數（trabecularnumber，Tb.N）和骨小梁分離度（trabecularseparation，Tb.Sp），并通過HE染色法觀察其股骨組織的病理變化。當造模組兔出現骨小梁排列稀疏、骨細胞數量減少、空骨陷窩數增多，且Tb.Th、Tb.N較Control組兔降低，Tb.Sp較Control組兔升高時，表明SONFH模型兔構建成功。將造模成功的24只兔按隨機數字表法分為模型組（Model組）PACs低劑量組（PACs-L組）PACs高劑量組（PACs-H組）、PACs高劑量 + RIPK1激活劑組（PACs-H+rRIPK1組），每組6只。根據動物與人的等效劑量進行換算，PACs-L組、PACs-H組兔分別灌胃 11.22mg/kg PACs并尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次；PACs-H+rRIPK1組兔在灌胃 22mg/kg PACs的同時尾靜脈注射 4μg/kg rRIPK1[，每天1次;Control組和Model組兔灌胃并尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次。各組兔均被持續干預4周。

2.2 兔血清中TNF- σ?σa，IL-6 含量檢測

末次給藥結束后，對各組兔進行耳緣靜脈采血，離心后取上清液，采用ELISA法以酶標儀檢測其血清中TNF- σ?α?α?α?α 、IL-6含量。

2.3 兔股骨微結構檢測

采完血后處死各組兔，分離出雙側股骨；清洗后，取部分右側股骨（剩余部分凍存，備用）放入多聚甲醛中固定 48h ，然后使用Micro-CT影像系統檢測其股骨的骨密度（bone mineral density，BMD）、Tb.Th、Tb.N和 Tb.Sp 。

2.4兔股骨組織的病理學形態觀察

取各組兔左側股骨，用 10% 乙二胺四乙酸進行脫鈣處理，然后進行常規石蠟包埋、切片；取部分切片進行HE染色，再利用光學顯微鏡觀察股骨組織的病理學形態，并計算空骨陷窩率：空骨陷窩率 空骨陷窩數/骨陷窩數 ×100% 。

2.5兔股骨組織細胞凋亡情況檢測

取“2.4\"項下各組兔剩余切片，經脫蠟、抗原修復后，加入 0.1% TritonX-100試劑進行通透處理，再以 5% 牛血清白蛋白封閉后，滴加TUNEL反應液孵育，再加入 ?4^′ ，6-二胱基-2-苯基吲哚（DAPI）染液復染細胞核；封片后，采用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況（凋亡細胞呈綠色熒光），并計算細胞調亡率：細胞凋亡率 凋亡細胞數/總細胞數 ×100% 。

2.6兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA表達檢測

取“2.3”項下各組兔凍存的右側股骨組織，研磨成粉，取適量，加入Trizol試劑提取總RNA；將上述總RNA反轉錄成cDNA后，以此cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系（ 20μL 為 2×SYBR Green Mix 10μL 、正/反向引物各 0.8μL 、cDNA模板 2μL 、無核酸酶水6.4μL 。PCR擴增程序為 95^°C 預變性 變性 5s ，60^°C 退火和延伸 30s ，共40個循環。以 β -actin為內參，采用 2^-ΔΔCt 法計算兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA的表達水平（結果以Control組為參照進行歸一化處理）。

2.7兔股骨組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白表達檢測

取“2.6\"項下各組兔右側股骨組織粉末，加入RIPA裂解液充分裂解，離心后取上清蛋白；將蛋白變性處理后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜，加入封閉液封閉;分別加入p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、MLKL、caspase-8、GAPDH一抗（稀釋比例均為 1：1 000 ），于 4^°C 下孵育過夜；加入相應二抗（稀釋比例為 1：1 000 ），于室溫下孵育1h；洗膜后，以ECL試劑顯影，并使用凝膠成像系統成像。采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達水平，以p-RIPK1與RIPK1、p-RIPK3與RIPK3、p-MLKL與MLKL的表達水平比值表示RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白的磷酸化水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS24.0軟件對數據進行統計分析。經Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗分析后，符合正態分布的計量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK- ?q 檢驗（方差齊時）。檢驗水準 α=0.05 。

3結果

3.1PACs對兔血清中炎癥因子含量的影響

與Control組比較，Model組兔血清中TNF- α 、IL-6含量均顯著升高 （Plt;0.05 ）；與Model組比較，PACs-L組和PACs-H組兔血清中TNF- ∝ IL-6含量均顯著降低0 （Plt;0.05 ），且PACs-H組降低效果更明顯（ （Plt;0.05） ；與PACs-H組比較，PACs-H+rRIPK1組兔血清中TNF- σ?α∝ IL-6含量均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結果見表2。

表2各組兔血清中TNF- ?α_?IL-6 含量比較 mmol/L）

a：與Control組比較， Plt;0.05：6 ：與Model組比較， Plt;0.05;c ：與 PACs-L組比較， Plt;0.05 ;d：與PACs-H組比較， Plt;0.05， □

3.2 PACs對兔股骨微結構的影響

與Control組比較，Model組兔BMD、Tb.Th、Tb.N均顯著降低，Tb.Sp顯著升高（ ）；與Model組比較，PACs-L組和PACs-H組兔BMD、Tb.Th、Tb.N均顯著升高，Tb.Sp均顯著降低 （Plt;0.05 ，且PACs-H組上述改善效果更明顯（ （Plt;0.05） ）；與PACs-H組比較， PACs-H+ rRIPK1組兔BMD、Tb.Th、Tb.N均顯著降低，Tb.Sp顯著升高 ?Plt;0.05 ）。結果見表3、圖1。

表3各組兔股骨微結構相關指標比較 ）

a：與Control組比較， Plt;0.05 ;b：與Model組比較， Plt;0.05 ;c：與PACs-L組比較， ?Plt;0.05 ；d：與PACs-H組比較， Plt;0.05

3.3PACs對兔股骨組織的病理學形態影響

Control組兔股骨組織結構正常、骨細胞分布均勻，空骨陷窩率為 （11.83±1.45）% 。與Control組比較，Model組兔股骨組織中骨小梁排列稀疏，骨細胞分布不均，空骨陷窩率[ （28.67±2.21）%] 顯著升高 （Plt;0.05） 。與Model組比較，PACs-L組和PACs-H組兔股骨組織中骨小梁排列密集，骨細胞數量增多，空骨陷窩率[分別為（21.33±1.67）% 、 （15.50±1.63）% 均顯著降低（ Plt; 0.05），且PACs-H組降低效果更明顯 （Plt;0.05） 。與PACs-H組比較， PACs-H+rRIPK1 組兔股骨組織中骨小梁排列稀疏，骨細胞數量減少，空骨陷窩率[ （24.17± 2.15）% 顯著升高（ （Plt;0.05） 。結果見圖2。

3.4PACs對兔股骨組織細胞凋亡的影響

與Control組[細胞凋亡率為 （2.52±0.88）%] 比較，Model組兔股骨組織細胞凋亡率[ （31.60±5.05）%] 顯著升高 （Plt;0.05） ）；與Model組比較，PACs-L組和PACs-H組兔股骨組織細胞凋亡率[分別為 （24.73±4.36）% ！1 （13.24±2.17）%] 均顯著降低 ），且PACs-H組降低效果更明顯 Plt;0.05 ）；與PACs-H組比較， PACs-H+ rRIPK1組兔股骨組織細胞凋亡率[ （28.12±5.35）%] 顯著升高 （Plt;0.05 0。結果見圖3。

圖1各組兔股骨微結構的顯微圖

箭頭：空骨陷窩。

圖2各組兔股骨組織的病理學形態顯微圖（HE染色）

圖3各組兔股骨組織細胞凋亡情況的顯微圖（TUNEL染色）

3.5PACs對兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA表達的影響

與Control組比較，Model組兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA表達水平均顯著降低（ ?Plt;0.05? ;與Model組比較，PACs-L組和PACs-H組兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA表達水平均顯著升高（ （Plt;0.05） ，且PACs-H組升高效果更明顯（ ；與PACs-H組比較，PACs-H+rRIPK1組兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA表達水平均顯著降低（ （Plt;0.05 。結果見表4。

表4各組兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA和通路相關蛋白表達情況比較 0

a：與Control組比較， Plt;0.05 ;b：與Model組比較， Plt;0.05 ;c：與PACs-L組比較， Plt;0.05 ;d：與PACs-H組比較， Plt;0.05 。

3.6PACs對兔股骨組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白表達的影響

與Control組比較，Model組兔股骨組織中RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白的磷酸化水平均顯著升高，caspase-8蛋白的表達水平顯著降低 （Plt;0.05） ）；與Model組比較，PACs-L組和PACs-H組兔股骨組織中RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白的磷酸化水平均顯著降低，caspase-8蛋白的表達水平均顯著升高 （Plt;0.05） ，且PACs-H組上述改善效果更明顯（ （Plt;0.05 ）；與PACs-H組比較， PACs-H+ rRIPK1組兔股骨組織中RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白的磷酸化水平均顯著升高，caspase-8蛋白表達水平顯著降低 Plt;0.05 。結果見圖4、表4。

4討論

股骨頭壞死，又稱股骨頭缺血性壞死，主要由創傷、酒精和激素等因素誘導；SONFH是非創傷性股骨頭壞死最常見的類型，其早期表現為髖關節鈍痛、隱痛，伴運動后髖關節疼痛加重，嚴重者可出現活動受限、跛行；如果不及時治療，可能發生髖關節股骨頭缺血性壞死，嚴重影響患者的行動

I：Control組；II：Model組;II：PACs-L組; ：PACs-H組；V： PACs-H+rRIPK1組。

圖4各組兔股骨組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關蛋白表達的電泳圖

研究表明，炎癥在SONFH進展中具有重要影響：炎癥因子的大量釋放不僅可通過刺激破骨細胞活化來導致骨形成減少，還可通過抑制股骨血流供應而最終誘發股骨壞死[]。既往研究表明，PACs可促進牙周韌帶干細胞向成骨細胞轉化，增強內源性牙槽骨再生[；可通過抑制成骨細胞凋亡，改善類固醇誘導的大鼠股骨病理損傷。這表明PACs對骨相關疾病具有一定的改善效果。本研究結果顯示，經PACs干預后，SONFH模型兔血清中TNF- ?∝，IL-6 含量均顯著降低；股骨BMD、Tb.Th、Tb.N均顯著升高，Tb.Sp顯著降低；骨小梁排列密集，骨細胞數量增多，空骨陷窩率顯著降低。這提示，PACs對兔SONFH具有明顯的改善作用。

SONFH可導致股骨頭的血流供應中斷，從而促進骨細胞凋亡和壞死，進而導致關節塌陷[。VEGF是一種由血小板、巨噬細胞、成骨細胞分泌的血管生長因子，在血管生成中起關鍵作用2。Pan等[2研究發現，上調VEGF表達可促進血管生成，從而改善SONFH。此外，BMP2對骨損傷的修復具有重要作用[13]。本研究結果顯示，經PACs干預后，模型兔股骨組織中VEGF、BMP2mRNA表達水平均顯著升高。這提示，PACs可促進模型兔的血管生成及骨形成，從而恢復壞死股骨頭的血流供應，修復骨組織。

細胞凋亡貫穿于股骨頭壞死的整個病理過程：在股骨頭壞死的早期階段，RIPK1與RIPK3結合形成壞死復合體，該復合體可招募磷酸化的效應蛋白MLKL，磷酸化的MLKL會形成寡聚物，并作為非特異性孔嵌人細胞膜和陽離子通道中，干擾細胞正常的動力學行為，最終導致細胞破裂[5]。caspase-8是凋亡通路的關鍵分子，可通過切割RIPK1或RIPK3而阻斷細胞壞死性凋亡[4]。目前已有研究顯示，抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路活化可減輕糖皮質激素誘導股骨頭壞死過程中的細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，與Control組比較，Model組兔股骨組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路蛋白的磷酸化水平和股骨組織細胞凋亡率均顯著升高，caspase-8蛋白的表達顯著下調，表明RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路激活可能與股骨細胞壞死性凋亡存在關聯。經PACs干預后，模型兔股骨組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路蛋白的磷酸化水平和股骨組織細胞凋亡率均顯著降低，caspase-8蛋白的表達顯著上調，提示PACs可能通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路來抑制股骨細胞的壞死性調亡。為進一步探究PACs與RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的關系，本研究在高劑量PACs的基礎上給予rRIPK1（RIPK1激活劑）進行聯合干預，結果顯示，高劑量PACs對模型兔的改善作用被rRIPK1逆轉，提示PACs對SONFH的改善作用可能是通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路激活來實現的。

綜上所述，PACs可能通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路激活，抑制股骨組織細胞凋亡，促進血管新生，從而改善兔SONFH。

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