直腸癌組織ｕＰＡ系統和ＶＥＧＦ表達與浸潤轉移的關系

閆春生　戰學雷

【摘要】 目的 研究尿激酶型纖溶酶原激活系統uPA,uPAR,PAI-1蛋白及血管內皮生長因子(VEGF)在直腸癌組織中的表達及其與直腸癌癌生物學行為的關系。方法 2005年1月至2006年1月，采用免疫組化S-P法檢測67例直腸癌及癌旁組織中uPA,uPAR,PAI-1及VEGF蛋白表達情況，同時對臨床病理學資料進行回顧性分析。結果 癌和癌周比較uPA,uPAR,PAI-1及VEGF蛋白陽性表達率明顯升高(P<0.01)，陽性產物主要分布在癌細胞胞質。侵及漿膜組陽性率明顯高于未及漿膜組(P=0.000,0.014,0.016,0.000)。uPA,uPAR蛋白在淋巴結轉移組中的陽性率明顯高于無淋巴結轉移組(P=0.002,0.008)。PAI-1蛋白在低分化組中的陽性率明顯低于中分化和高分化組(P<0.05)。uPA,uPAR及VEGF蛋白陽性率在直腸癌組織不同分化程度間差異無顯著性。在直腸癌組織中uPA,uPAR蛋白的表達呈顯著正相關(r=0.653,P<0.001)。在uPA,uPAR蛋白同時陽性的41例病例中，有28例發生淋巴結轉移，與陰性組(4/15)相比，轉移發生率明顯增高(P<0.01)。直腸癌組織中uPA蛋白表達與VEGF表達顯著正相關(r= 0.300,P<0.05)。PAI-1蛋白表達與VEGF表達具有極顯著正相關性(r=0.413,P<0.01)。應用COX回歸模型進行多變量分析并采用向前逐步回歸法，僅浸潤深度、uPA表達和病理類型對淋巴結轉移有影響。結論 uPA,uPAR,PAI-1及VEGF蛋白在直腸癌組織中表達增強，uPA,uPAR與直腸癌浸潤轉移密切相關。

【關鍵詞】 直腸癌；uPA系統；血管內皮生長因子；浸潤；轉移；免疫組化

Expression of urokinase-type plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in rectal cancer and its correlation with invasion and metastasis

YAN Chun-sheng,ZHAN Xue-lei.Department of Surgery,Tonghe Peoples Hospital,Heilongjiang 150900，China

【Abstract】 Objective To detect the expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA),uPA receptor (uPAR),plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rectal cancer (RC) and to reveal their correlation to the major clinicopathological characteristics including tumor invasion and metastasis.Methods Expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF was examined in the tissue sections from 67 cases of RC using streptoavidin-biotin-peroxidase immunohistochemistry method.Results The expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF was mainly located in the cytoplasm of RC cells.The expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF in RC was significantly higher than in the cancer-adjacent tissue (P<0.01).The expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF in RC with serosa invasion was significantly higher than that in cancer without serosa invasion (P<0.05).Positive rates of staining for uPA and uPAR in GC with lymph node metastasis were significantly higher compared to cancer without lymph node metastasis (P=0.002 and 0.008 respectively).The expression of PAI-1 was significantly associated with the differentiation degree of cancer (P<0.01),while no relationship was found between the expression of uPA,uPAR,VEGF and the differentiation degree of cancer.The expression of uPA was correlated with uPAR in cancer tissue(r=0.653,P<0.001).In 41 cases positive for uPA and uPAR,28 were with lymph node metastasis (P<0.01,compared with 4/15).Positive correlation was observed between the expression of uPA and VEGF protein (r=0.300,P<0.05),and between PAI-1 and VEGF (r=0.413,P<0.01).Multivariate Cox regression analysis indicated that only the depth of invasion,the expression of uPA and the differentiation affected lymph node metastasis in RC.Conclusion Expression of uPA,uPAR,PAI-1 and VEGF protein is increased in RC.uPA and uPAR may play an important role in the invasion and metastasis through VEGF which promotes angiogenesis.

【Key words】 Urokinase-type activator system;Vascular endothelial growth factor； Rectal cancer；Invasion；Metastasis；Iimmunohistochemistry

尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種蛋白水解酶，其介導的纖維蛋白降解作用能破壞細胞外基質和基底膜，在腫瘤浸潤轉移中起重要作用［1-2］。腫瘤誘導的血管生成反應亦與其生物學行為密切相關，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認為是作用最強、特異性最高的血管生成調控因子［3］。筆者采用免疫組織化學方法檢測67例直腸癌組織中uPA,uPAR,PAI-1及VEGF的表達，探討其與直腸癌生物學行為的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2005年1月至2008年1月直腸癌手術切除標本67例，術前未接受過抗腫瘤治療。男54例,女13例,年齡34~78歲。所有病例均經病理診斷證實。其中潰瘍型37例(55.2%),腫塊型5例(7.5%),浸潤型25例(37.3%)；腺瘤癌變4例(5.9%)，高分化腺癌20例(29.9%),中分化腺癌26例(38.8%)，粘液腺癌14例(20.9%)，印戒細胞癌3例(4.5%)。Dukes A期3例(4.5%)，B期55例(82.1%)，C期8例(11.9%)，D期1例(1.5%)。以癌旁組織為對照。所有標本組織經40 g/L多聚甲醛固定，常規石蠟包埋。4 μm厚連續切片。

1.2 方法 采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)方法。兔抗人uPA蛋白多克隆抗體(BA0405)、兔抗人uPAR蛋白多克隆抗體(BA1368)、兔抗人PAI-1蛋白多克隆抗體(BA1334)均購自軍事醫學科學院，工作濃度分別為1∶50，1∶100，1∶100。VEGF多克隆抗體、免疫組化S-P試劑盒均購自福州邁新生物技術公司，VEGF工作濃度為1∶50。每批染色均用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照.染色結果判斷分別按陽性細胞百分數及染色強度計分。陽性細胞數為0，計0分；1%~25%計1分；26%~50%計2分；>50%計3分。染色陰性計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。兩種積分相加，積分為0~2分，表示陰性(-)；積分為3~4分，表示陽性(+)；積分為5~6分，表示陽性(++)。+、++均視為陽性表達。

2 結果

2.1 uPA，uPAR，PAI-1蛋白的表達 uPA，uPAR蛋白的陽性產物主要位于直腸癌細胞的胞質中，強度深淺不一。腫瘤內少量成纖維細胞、血管內皮細胞可見較弱的陽性表達。PAI-1蛋白的陽性產物也主要定位于直腸癌細胞的胞質中，但與分化程度有關：在分化高的直腸癌組織，腫瘤細胞呈彌漫性胞質著色；隨著分化程度降低，染色有加深趨勢，部分胞質中出現棕褐色顆粒。上述三種蛋白在癌旁組織都有不同程度的陽性表達。正常直腸黏膜上皮多呈陰性表達。VEGF蛋白陽性信號主要定位于癌細胞胞質，其表達呈明顯異質性，在低分化癌和印戒細胞癌中的表達多呈強陽性，一些血管內皮細胞也可見弱的VEGF表達。在癌旁組織中，大部分腺上皮呈陰性表達。直腸癌組織中uPA，uPAR，PAI-1，VEGF蛋白的陽性表達率分別為68.7%，68.7%，70.1%和76.2%，明顯高于他們在癌旁組織中的陽性表達，分別為28.4%，31.3%，40.3%和20.9%，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.2 uPA，uPAR，PAI-1，VEGF蛋白表達和臨床病理因素的關系 uPA，uPAR，PAI-1，VEGF蛋白在侵及漿膜組中的陽性表達率明顯高于未及漿膜組，差異具有顯著性意義(表1)。uPA，uPAR蛋白在淋巴結轉移組中的陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，差異具有顯著性意義。PAI-1蛋白在低分化組中的陽性率明顯低于中分化和高分化組，差異有顯著性(P<0.05)。uPA，uPAR，VEGF蛋白陽性率在不同分化程度間差異無顯著性。在直腸癌組織中uPA與uPAR蛋白的表達具有極顯著正相關性(r=0.653,P<0.001)。在uPA，uPAR蛋白同時陽性的41例病例中，有28例發生淋巴結轉移，與陰性組(4/15)相比，轉移發生率明顯增高(P<0.01)。

2.3 uPA，uPAR，PAI-1與VEGF蛋白表達和淋巴結轉移的相關性 直腸癌組織中uPA蛋白表達與VEGF蛋白表達顯著正相關(r=0.300,P=0.014<0.05)。PAI-1蛋白的表達與VEGF蛋白表達具有極顯著正相關性(r=0.413,P=0.001<0.01)。uPAR與VEGF蛋白表達呈正相關(r=0.206,P=0.095)。應用COX回歸模型進行多變量分析并采用向前逐步回歸法，得出在諸多臨床病理因素以及uPA,uPAR,PAI-1和VEGF蛋白等指標中，僅浸潤深度、uPA表達和病理類型被引進方程，對淋巴結轉移有影響(表2)。

3 討論

uPA介導的纖溶酶降解系統在腫瘤浸潤轉移過程中發揮重要作用。uPA是一種絲氨酸蛋白酶，由多種腫瘤細胞或其他細胞分泌，通過與細胞膜上的特異性受體uPAR結合發揮作用，激活纖溶酶原成為纖溶酶。另外，uPA還激活潛在活性的膠原酶，與纖溶酶一起均促使細胞外基質(包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型膠原等)和血管基膜的降解，最終導致腫瘤細胞的浸潤和轉移［4］。uPA的活性被他的特異性抑制劑PAI-1所調控。本研究的結果顯示uPA，uPAR，PAI-1蛋白主要定位于直腸癌組織中的癌細胞胞質，腫瘤內少量成纖維細胞、血管內皮細胞可見較弱的uPA，uPAR蛋白陽性表達。uPA，uPAR，PAI-1蛋白在直腸癌組織中的表達較癌旁組織明顯增高(P<0.01)，表明隨著細胞惡性程度的增高，uPA，uPAR，PAI-1蛋白表達呈增高趨勢。其他學者利用ELISA和免疫組織化學方法檢測uPA，uPAR蛋白表達水平時，亦發現癌中心、癌邊緣和正常組織中uPA、uPAR、PAI-1蛋白活性逐漸降低［5-6］，與本結果基本一致。筆者還發現uPA，uPAR蛋白在侵及漿膜組中的陽性表達率明顯高于未及漿膜組(P<0.05)，在淋巴結轉移組中的陽性率明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.01)，差異均具有顯著性意義，進一步證實了uPA/uPAR系統參與了直腸癌的侵襲和轉移過程，這可能是因為高表達uPA和uPAR蛋白的癌細胞降解細胞外基質和基底膜成分的能力增強，使這部分細胞更易向組織深層和淋巴管浸潤，并導致遠處轉移。結果顯示，在直腸癌組織中uPA和uPAR蛋白的表達存在顯著的正相關(r= 0.653,P<0.001)，提示在直腸癌侵襲轉移過程中，對細胞外基質和基底膜的降解作用是二者共同作用的結果。在uPA，uPAR蛋白同時陽性的41例病例中，有28例發生淋巴結轉移，與陰性組(4/15)相比，轉移發生率明顯增高(P<0.01)，提示在直腸癌侵襲轉移過程中，uPA，uPAR協同高表達時，腫瘤細胞可能具有更高的移動性和侵襲力。最近的研究表明，uPA和uPAR結合后可促進整合素介導的信號傳導作用，而這一信號傳導作用又進一步促進腫瘤的轉移［7-8］。目前有關PAI-1在腫瘤生物學中的確切作用還不清楚，他在纖溶酶原激活系統中可能擔當重要的調節劑或者是腫瘤細胞防止自身降解的保護劑而不是這個系統單純的抑制劑［9］。也有學者認為，PAI-1在腫瘤浸潤轉移中與uPA，uPAR有協同和調節作用。

VEGF是一類作用最強、特異性最高的可溶性血管生成促進因子，他與內皮細胞上的兩個特殊受體flt和flk(kDk)結合，刺激內皮細胞增生，在腫瘤血管發生中起著重要作用。在腫瘤血管的生成過程中，腫瘤也完成了擴展、侵襲和轉移，故VEGF與腫瘤的生長、侵襲和轉移等特性密切相關［10-11］。本結果表明，VEGF蛋白主要表達于直腸癌細胞的胞質中，一些血管內皮細胞也可見弱表達。VEGF在直腸癌組織中的陽性表達(76.1%)明顯高于癌旁組織(20.9%)(P<0.01)，VEGF的表達還與腫瘤浸潤深度呈明顯正相關(P<0.01)。說明VEGF的表達對腫瘤細胞的惡性表型有一定的作用，隨著腫瘤惡性程度的增高以及侵襲性的增強，癌細胞必須通過增加VEGF等促血管生成因子的分泌來刺激血管新生，以滿足其自身營養需求。腫瘤新生血管形成與ECM降解是惡性腫瘤生長、浸潤轉移過程中的關鍵因素。uPA系統在腫瘤新生血管形成過程中起重要作用。VEGF可直接刺激腫瘤新生血管形成，并上調內皮細胞表達uPA，uPA也能直接激活VEGF［12］。VEGF與uPA系統相互作用，形成正反饋調節環，極大增加uPA產物，降解ECM及微血管基底膜，為內皮細胞遷移、增生以及腫瘤新生血管形成有利的微環境，同時也有利于癌細胞脫落進入血管或向鄰近組織擴散，為腫瘤的浸潤、轉移創造條件。而PAI-1對腫瘤新生血管形成的調節主要包括兩方面：首先PAI-1抑制uPA活性，防止過分的ECM降解，適度的ECM降解則是內皮細胞遷移、增生所必需。其次，PAI-1與uPAR，FN，VN及整合素等相互作用，通過復雜的信號轉導機制調節內皮細胞的黏附、增生和分化，促進腫瘤血管的發生、形成［13-14］。本結果顯示，直腸癌組織中uPA，PAI-1蛋白表達與VEGF蛋白表達顯著正相關(P<0.01)，說明uPA系統與VEGF在直腸癌的血管生成中可能起著協同作用，他們在直腸癌的發生發展和浸潤轉移過程中起著重要作用，uPA在腫瘤轉移中的作用可能部分由于其對血管生成的作用。因此，采用uPA拮抗劑及血管生成抑制劑可能會抑制直腸癌的浸潤和轉移。

參 考 文 獻

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