頭針誘導神經干細胞的增殖分化

周 利 張曉艷 張紅星 鄒 燃 劉銀妮 王 瓊

缺血性腦損傷可以觸發腦內分子和細胞修復機制,誘發神經干細胞的增殖分化,引起成年腦神經元再生。新生的神經元還可以遷移到病灶區代替一部分死亡的神經元而發揮一定的功能[1]。通過適當的外部干預措施放大這種神經再生就有可能促進腦損傷后的自我修復。本實驗采用線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞模型,通過觀察DG區BrdU陽性細胞和BrdU/NeuN雙標陽性細胞的表達,驗證頭針能誘導內源性神經干細胞的增殖和分化,并減少其隨時間增殖而衰減。從而借此探討頭針治療腦缺血的理論依據,為臨床治療腦缺血奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康wistar雌性大鼠(SPF級)100只(考慮實驗中有死亡及剔除的大鼠),體重為(200±20)g,由湖北省實驗動物中心提供(SCXK(鄂)2004-0007)。甲醛溶液,水合氯醛(上海試劑一廠),cy3羊抗兔IgG和FITC羊抗鼠IgG購自三鷹生物科技有限公司,hoechst33258和防淬滅劑封片購自碧云天生物技術研究所,5-溴脫氧尿核苷(BrdU)液購自美國sigm a公司,BrdU單克隆抗體、神經元核性蛋白(NeuN)購自美國santa cruz公司;LH 202H型韓氏穴位神經刺激儀(北京華威有限公司生產)。

1.2 動物模型制備及鑒定

1.2.1 動物模型制備 參照Longa等報道的線栓法[2],并加以改進;以10%水合氯醛(30 m g/kg體重)腹腔麻醉后,在大鼠頸部正中切口暴露右側頸總動脈(CCA),分離出頸內動脈(ICA),頸外動脈(ECA);以動脈夾阻斷CCA血流,再在ECA殘端剪0.2mm的小口,插入直徑約0.22mm、長為 60 mm的尼龍線;輕推尼龍線端經CCA分叉部沿ICA入顱,至大腦中動脈(MCA),遇阻即止,尼龍線插入深度約(18±0.5)mm;結扎ECA殘端口,縫皮;缺血1 h后輕輕向外拉尼龍線,至有阻力感時提示尼龍線頭部已離開ICA而位于ECA殘端,將體表外的尼龍線剪斷,恢復大腦中動脈的血供,實現再灌注;假手術組則不插線栓,不做再灌注;縫合切口后大鼠保溫喂養,并觀察造模大鼠生命指征。

1.2.2 動物模型鑒定 觀察造模大鼠清醒后行為學改變,按Zea Longa五級評分標準[2]進行神經功能缺損評分。0分為無神經缺損癥狀;1分為不能伸展對側前爪;2分為行走時向偏癱側轉圈;3分為向偏癱側傾倒;4分為不能自發行走,意識喪失。本實驗剔除其中0分及4分者。

1.3 動物分組

在實驗過程中造模后的大鼠死亡18只,剔除12只。將成功模型鼠隨機分為2組：模型組和治療組(均設7、14、28 d時間點,各時間點n=10)。假手術組10只(設7、14、28 d時間點,各時間點 n分別為 4、3、3 只)。

1.4 治療

1.4.1 所有模型組和假手術組大鼠造模后常規飼養,不予任何治療。

1.4.2 頭針組造模后即可行頭針治療。頭針選穴依據《頭針國際標準化方案》,選取頂顳后斜線,頂顳前斜線。大鼠穴位定位根據華氏等介紹的大鼠穴位圖譜[3],模擬人體經穴定位。30號1寸“瑞琪爾”(NATURA L)牌一次性無菌針灸針,進針深度約0.5 cm,進針后接韓氏治療儀,疏密波,頻率2 H z/100 Hz,強度2m A,每次20m in,每天1次。

1.5 BrdU標記法

將BrdU用生理鹽水配制成5mg/m l的溶液。各組大鼠于處死前1 d腹腔注射BrdU(50mg/kg),每2 h注射1次,共注射4次,最后1次注射結束24 h后處死大鼠。

1.6 標本的采集與處理

標本采集：各組大鼠于再灌注后各時間點將大鼠用100 g/L水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉,用多聚甲醛經心臟灌注固定,取腦后固定24 h,待用。

免疫熒光檢測：選擇含海馬齒狀回的腦組織連續6μm冠狀切片,(1)常規脫蠟至水;(2)切片入3%H2 O2-甲醇室溫下孵育30 min;(3)微波修復;(4)10%羊血清濕盒內37℃下孵育30 min;(5)分別用一抗為兔抗的BrdU(1∶100)和一抗為鼠抗的NeuN(1∶100)混合液滴加于標本上進行孵育,濕盒內4℃過夜;(6)cy3羊抗兔IgG和FITC羊抗鼠IgG混合液,濕盒內37℃孵育45 min;(7)hoechst 33258染核。上述各步驟除羊血清孵育后不洗外,其他各步驟均用0.01 M PBS震蕩漂洗5 min×3次;(8)防淬滅劑封片;(9)每只大鼠隨機選取海馬3張切片,高倍物鏡下取缺血側海馬6個非重疊視野,計數其中BrdU、BrdU/NeuN陽性細胞數。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 頭針對神經功能缺損評分的影響 假手術組無行為學改變,故與模型組、頭針組在各時相上的NSS比較均有顯著性意義(P＜0.01);頭針組與模型組在各時相上的NSS比較,28 d組有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

2.2 BrdU單標 各組大鼠的DG均可見BrdU陽性細胞,在缺血再灌注后DG區BrdU陽性細胞數增加更明顯,7 d達到峰值,14 d后逐漸減少,28 d時明顯下降。模型組、頭針組各時間點陽性細胞數較假手術組明顯增加,差異有顯著性(P＜0.01);頭針組的BrdU陽性細胞各時間點較模型組亦明顯增加,差異有顯著性(P＜0.01)(表2)。2.3 BrdU/NeuN陽性細胞數 假手術組中海馬僅存在少量BrdU/NeuN陽性細胞,而缺血再灌注后則可見BrdU/NeuN陽性細胞數有顯著變化(P＜0.01),海馬的陽性細胞開始增加,28d達到峰值。頭針組陽性細胞數相對于模型組也有顯著差異(14、28d組 P＜0.01)(表3)(圖1～9)。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(±s)

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(±s)

注：與相同時間點的假手術組比較,*P＜0.01;與相同時間點的模型組比較,▲P＜0.05

組別 NSS 7d 14d 28d假手術組 - - -模型組 2.80±0.42* 2.70±0.48* 2.60±0.52*頭針組 2.60±0.70* 2.20±0.79* 1.80±0.79*▲

表2 各組BrdU陽性細胞數比較(±s)

表2 各組BrdU陽性細胞數比較(±s)

注：與相同時間點的假手術組比較,*P＜0.01;與相同時間點的模型組比較,▲P＜0.01

組別 BrdU陽性細胞數7d 14d 28d假手術組 40.00±2.58 39.33±3.06 40.00±2.00模型組 105.30±4.11* 88.50±4.25* 76.30±5.17*頭針組 136.70±4.06*▲ 94.60±3.95*▲ 85.90±4.18*▲

圖1 假手術7d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖2 模型7d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖3 頭針7d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖4 假手術14d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖5 模型14d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖6 頭針14d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖7 假手術28d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖8 模型28d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

圖9 頭針28d組Brdu/NeuN陽性細胞表達水平(×400倍)

表3 各組大鼠BrdU/NeuN陽性細胞數比較(±s)

表3 各組大鼠BrdU/NeuN陽性細胞數比較(±s)

注：與相同時間點的假手術組比較,*P＜0.01;與相同時間點的模型組比較,▲＜0.01

組別 BrdU/NeuN陽性細胞數7d 14d 28d假手術組 2.75±1.26 2.33±0.56 2.67±0.58模型組 7.00±2.11* 13.70±2.98* 22.80±2.62*頭針組 7.80±3.01* 19.20±3.05*▲ 32.70±3.33*▲

3 討 論

神經干細胞是一組具有自我更新和多分化潛能的細胞。成年哺乳動物中樞神經系統內多個部位存在神經干細胞,其中側腦室壁的腦室下區(subventricularzone,SVZ)和DG是神經干細胞的主要分布區[4]。這些有分化潛能的干細胞通常處于“靜止”狀態只有在某些特殊因素作用下或者受到損傷刺激時才被激活,重新進入細胞增殖周期,并進一步分化為特定功能的神經細胞[5]。腦缺血可激活NSCs的增殖分化,為腦缺血的自我修復帶來了希望。但是僅靠腦缺血調動內源性NSCs是遠遠不夠的,一方面NSCs的數量不足;另一方面調節增生、遷移、分化、神經元修復和突觸形成的因子也不足[6]。頭針在臨床上治療缺血性腦卒中已經取得了明顯療效,且頭針可明顯縮小腦梗死的面積,減少壞死灶周圍的水腫和炎癥反應[7],能使多種神經營養因子(如腦源性神經營養因子、堿性成纖維生長因子等)的分泌增多,而腦缺血后神經營養因子的表達上調又是神經干細胞增殖、遷移、分化、網絡化的重要因素[8]。因此我們推測頭針治療缺血性腦卒中可能促進了內源性NSC參與腦缺血的修復。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物,在細胞增殖周期的S期嵌入細胞核的DNA,因而BrdU陽性細胞被看作具有增殖活性的細胞,是自體神經干細胞增殖的標記物[9]。Iw ai等利用沙鼠全腦缺血/再灌注模型發現,模型動物5 d后海馬的BrdU陽性細胞開始增加,10 d左右達到高峰,20 d時降至對照組水平[10]。李常新等發現電針治療促使梗死灶邊緣、對側鏡區BrdU陽性細胞增多,隨著治療時間增加,細胞增多更明顯,提示電針治療可促使神經前體NSC增殖及遷移[11]。本研究結果顯示,正常成年大鼠腦組織中只有少量 BrdU陽性細胞存在,腦缺血再灌注后BrdU陽性細胞表達增強,7 d達到峰值,然后開始遞減,經頭針刺激后BrdU陽性細胞表達明顯高于模型組,故可以認為頭針治療能夠促進NSCs的增殖。

神經元核心抗原(neuron-specific p rotein/neural nuclei,NeuN)是一種可溶的核蛋白,是神經元的標記蛋白,其免疫反應性在神經元分化成熟后即開始出現[12],因此BrdU/NeuN陽性細胞是向神經元方向分化的神經干細胞。本研究免疫熒光結果顯示BrdU/NeuN陽性細胞數在再灌注后14 d明顯增加,28 d后達到高峰,這說明腦缺血后增殖的神經干細胞14 d后開始分化為神經元,頭針組28 d BrdU/NeuN陽性細胞數明顯高于模型組,提示頭針對增殖后的NSCs分化為神經元也起到促進作用。

1 李 歐,朱心紅,高天明.成年大鼠全腦缺血性腦損傷后神經前體細胞的增殖周期變化.南方醫科大學學報,2006,26(5)：564-566,569.

2 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversiblem iddle cerebralartery occlusion without craniectom y in rats.Stroke,1989,20(1)：84-91.

3 華興邦.大鼠穴位圖譜的研制.實驗動物與動物實驗,1991,(1)：1-5.

4 Gage H F.Mammalian neural stem cells.Science,2000,287(5457)：1433-1438.

5 Bjornson CR,R ietzeR L,Reynolds BA,et al.Turing b rain into blood：A ematopoietic fate adopted by adult neu ral stem cells in vivo.Science,1999,283(5401)：534-537.

6 周盛年,孫 弦.神經干細胞與腦缺血治療的相關研究.中國卒中雜志,2008,3(5)：381-384.

7 W ada K,Ito M,M iyazawa T.Repeated hyperbaricoxygen induces ischemic tolerance in gerbil hippocampus.Brain Res,1996,740(1-2)：15-20.

8 唐 強,徐志華,白 晶.電針對大鼠腦梗死后內源性神經干細胞增殖遷移的影響.針灸臨床雜志,2008,24(8)：49-51.

9 CiaroniS,Cecchini T,FerriP,et al.Impairmen t of neuralp recu rsor proliferation increases survivalof cell progeny in the adult rat dentate gyrus.M ech Ageig Dev,2002,123(10)：1341-1352.

10 IwaiM,H ayashi T,Zhang M R,et al.Induction ofhighly polysialylated neu ral cell adhesion molecu le(PSA-NCAM)in post ischem ia gerbil hippocampus mainly dissociated w ith neu ral stem cell proliferation.Brain Res,2001,902(2)：288-293.

11 李常新,黃如訓,陳立云,等.電針對腦梗死大鼠神經前體細胞增殖水平的影響.中華物理醫學與康復雜志,2004,12(26)：725-728.

13胡曉松.NeuN及其在局灶性腦缺血再灌注研究中的應用.華西醫學,2004,19(2)：329-330.