扶正化瘀法調控脂聯素對非酒精性脂肪性肝病脂質代謝的影響

王雨秾，吳春嵐，孫敏梓

（上海中醫藥大學，上海201203）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺傳-環境-代謝相關性疾病，包括單純性脂肪肝及由其進展而來的脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化。NAFLD的發病機制尚不明確，但較為公認的機制為以氧化應激和脂質過氧化為軸心的“二次打擊學說”，認為初次打擊主要為胰島素抵抗（insulin resistant，IR），二次打擊主要為反應性氧化代謝產物增多，導致脂質過氧化，進而引起脂肪變性的肝細胞發生炎癥、壞死甚至纖維化。IR貫穿NAFLD發病始終，是造成NAFLD脂質代謝紊亂的關鍵。同時發現，脂聯素具有增加胰島素敏感性、抗炎、增加葡萄糖攝取、促進脂肪酸氧化等作用，并且可以介導肝內脂肪變化。因此，通過調控脂聯素水平來改善IR，正成為調節NAFLD脂質代謝水平的新切入點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 Wister雄性大鼠60只體重170 g左右，來源于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可號：SCXK（滬）2008-0016。

1.1.2 實驗藥物 人參皂苷Re，批號：0609，7000 mg，純度：90%，吉林大學有機教研室；丹參酮IIA標準品1200mg，純度：98%，上海順勃生物技術有限公司；辛伐他汀，批號：09475，規格：20 mg/片×6盒，杭州默沙東制藥有限公司。

1.1.3 高脂飼料的配方 本課題采用Professor Edward W.Kraegen實驗室長期運用的大鼠高脂飼料誘導胰島素抵抗，該飼料中含有脂肪59%，碳水化合物20%，蛋白質21%，其余如纖維、維生素、微量元素等的含量與正常飼料相同。

1.1.4 主要試劑 脂聯素試劑盒T228-10，Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.；血糖試紙 ACCU－CHEK，生化試劑，羅氏診斷有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的誘導和給藥方法 Wister大鼠雄性60只，隨機分成正常組、高脂組、Re組、Re+丹參酮ⅡA組、丹參酮ⅡA組、對照組6組，每組10只，籠養 1 w，以適應環境。第2周開始，除正常組外，每組用高脂飼料喂養，自由取食，每只每天18 g，每天給飼料前稱量大鼠體重，記錄。同時，稱量大鼠吃剩的飼料，記錄。喂養2 w后，開始對高脂飼料喂養大鼠進行藥物干預，即：對照組予辛伐他汀7 mg/（kg·d），人參皂苷Re組予Re 50 mg/（kg·d），丹參酮ⅡA組予丹參酮IIA 5 mg/（kg·d），Re+丹參酮IIA組分別予Re 50 mg/（kg·d）+丹參酮IIA 5 mg/（kg·d），連續灌胃4 w、給藥期間，各組仍予高脂飼料喂養，自由取食，每天稱量體重，記錄。喂養4 w后采集動物血清、皮下脂肪、肝臟、下肢肌肉組織各一份，-70℃保存。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 血清膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸檢測 所有動物血清標本經離心機離心，轉速4000轉/min，時間4 min，抽取上層血清，采用全自動生化儀檢測甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、游離脂肪酸（FFA）含量。

1.2.2.2 血清脂聯素檢測 采用ELISA法測定血清脂聯素（ADP）濃度。實驗操作完全按試劑盒指示操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計分析。所有計量資料采用（±s）進行描述，各組間采用方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠喂養前后的體重變化比較結果見表1。

表1 各組大鼠喂養前后體重變化 （g，±s）

表1 各組大鼠喂養前后體重變化 （g，±s）

組別 n 喂養前體重 喂養后體重 體重增加量正常組 10 142.64±5.20 269.09±16.77 126.45±17.15高脂組 10 144.83±2.14 285.33±17.48 140.50±16.69 Re 組 10 140.00±5.33 277.17±18.55 137.17±20.54 Re+丹參酮IIA 組 10 142.50±2.88 278.33±28.42 135.83±26.16丹參酮 IIA 組 10 141.00±6.39 275.67±26.20 134.67±22.88對照組 10 140.5±5.50 262.17±8.66 121.67±8.55

由表1可以看出，各組間體重增量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），各用藥組均較高脂組體重增加緩慢，中藥有延緩大鼠體重增加的趨勢，但其體重增量仍高于辛伐他汀給藥組，提示中藥對IR抵抗的大鼠體重的影響不及西藥辛伐他汀明顯。

2.2 各組大鼠血清甘油三酯（TG）與血清膽固醇（CHOL）含量比較

結果見表2。由表2可以看出，與對照組比較，Re組、Re+丹參酮IIA組甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）含量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；Re+丹參酮IIA聯合用藥降低CHOL作用在各藥物干預組中最明顯，優于西藥辛伐他汀。2.3 各組大鼠血清游離脂肪酸（FFA）與血清脂聯素（ADP）含量比較結果見表3。

表2 各組大鼠血清甘油三酯與血清膽固醇含量比較 （mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血清甘油三酯與血清膽固醇含量比較 （mmol/L，±s）

注：與正常組比較，1）P<0.05；與對照組比較，2）P<0.05

組別 n 甘油三酯（TG） 膽固醇（CHOL）正常組 10 0.39±0.112） 0.87±0.122）高脂組 10 0.49±0.14 1.04±0.12 Re 組 10 0.45±0.192） 1.09±0.261）Re+丹參酮ⅡA組 10 0.44±0.102） 1.02±0.29丹參酮ⅡA組 10 0.56±0.111） 1.05±0.15對照組 10 0.64±0.281） 1.18±0.161）

表3 各組大鼠血清游離脂肪酸與血清脂聯素含量比較 （±s）

表3 各組大鼠血清游離脂肪酸與血清脂聯素含量比較 （±s）

組別 n FFA（mmol/L） ADP（ng/mL）正常組 10 0.58±0.09 2.11±0.28高脂組 10 0.50±0.26 2.02±0.39 Re組 10 0.63±0.38 1.87±0.19 Re+丹參酮IIA組 10 0.57±0.11 2.06±0.27丹參酮 IIA 組 10 0.72±0.28 1.88±0.22對照組 10 0.65±0.36 1.91±0.24

由表3可以看出，各組間兩兩比較，FFA差異無統計學意義（P＞0.05）。但結合各組均值比較發現，各藥物干預組較高脂組FFA均呈現上升趨勢，提示藥物干預有促進脂肪代謝的作用。同時發現，Re組FFA水平接近西藥對照組，Re+丹參酮IIA組FFA水平接近正常組，提示Re單獨或聯合用藥均具有促進脂肪代謝的作用，且聯合用藥可起到協同作用，促進脂肪分解趨勢更顯著。ADP在各組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。Re組、丹參酮IIA組ADP水平接近對照組水平，而Re+丹參酮IIA組ADP水平接近正常組，優于其他組，提示Re+丹參酮IIA聯合用藥對改善高脂飲食誘導的IR模型的ADP水平有一定作用。

3 討論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝損傷，目前認為脂代謝異常（尤其是 TG）與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）所引發的高游離脂肪酸（FFA）、高胰島素血癥是NAFLD發病機制的中心環節。NAFLD根據其在肝臟組織中的脂肪變程度和炎癥情況，可從單純性脂肪肝進展成非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），并進而進展到肝硬化［1］，并且通過加劇胰島素抵抗而誘發動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的發生。

脂聯素是由Scherer P E等［2］首次發現脂肪特異性分泌蛋白具有調節免疫和機體代謝的雙重作用，在免疫調節的同時，通過內分泌、旁分泌、自分泌的方式調節機體代謝。目前研究發現的兩種脂聯素受體，脂聯素受體1（AdipoR1）主要在骨骼肌中表達，脂聯素受體2（AdipoR2）主要在肝臟表達。脂聯素須與其相應受體結合后，通過激活AMP活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）［3］及有絲分裂原活化蛋白激酶P38（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）兩個途徑，引起下游一系列信號分子的改變，使乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptorα，PPARα）磷酸化［4］，通過影響胰島素分泌、調節脂類氧化葡萄糖攝取、抑制巨噬細胞轉化，從而發揮降糖、降脂，改善IR等生物學作用［5-6］；并通過影響肝臟脂肪代謝、周圍組織對胰島素的敏感性、炎癥因子產生等阻斷對肝臟的“初次打擊”和“二次打擊”，從而抑制NAFLD的形成和進展。

人參皂苷Re能起到自由基陷阱作用，可以保護所有的未飽和脂肪酸，阻止其被氧化；且對小鼠的體液免疫和細胞免疫均有刺激作用，增強免疫功能。研究發現，人參皂苷Re在2型糖尿病鼠模型中具有顯著的抗高血糖活性，其可以顯著改善葡萄糖耐量，同時可顯著降低血清胰島素水平、體重、攝食量和血膽固醇水平，并增加能量消耗和胰島素引起的糖分配［7］。進一步研究發現，人參皂苷Re可起到“類胰島素”的作用，并從更深層次上解釋了人參皂苷Re的降糖機制［8］。丹參酮ⅡA可有效地清除氧自由基［9］，并可使血漿中總膽固醇、甘油三酯［10］和低密度脂蛋白的含量降低，高密度脂蛋白的水平升高，從而起到降血脂的作用［11］。

本實驗發現，FFA濃度伴隨ADP水平提高呈下降趨勢，同時血清TG、CHOL隨之也呈現不同程度的下降趨勢。其機制可能與胰島素介導的葡萄糖利用率下降以及脂質氧化率增高和游離脂肪酸水平降低有關。與目前研究提示ADP的激活代謝過程相符合。

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