VEGF—C在NSCLC中的表達及其臨床意義

張波　朱佳妮　 陳保富　章霞　葉敏華　朱成楚

[摘要] 目的 血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）傾向于擴散至淋巴系統(tǒng)，被認為是最具特異性的淋巴管生成調(diào)控因子。本研究旨在探討VEGF-C在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義。 方法 采用免疫組化檢測70例非小細胞肺癌標本中VEGF-C的表達，以癌旁組織19例、正常肺組織20例為對照。 結(jié)果 VEGF-C在NSCLC中的陽性表達率為78.6%，明顯高于在癌旁組織和正常肺組織的表達；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的肺癌標本中VEGF-C陽性表達率明顯高于在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組肺癌中表達率；低分化組的肺癌標本中VEGF-C陽性表達率高于在中高分化組中表達率。Logistic回歸分析顯示腫瘤組織分化程度是VEGF-C蛋白陽性表達影響因素。 結(jié)論 VEGF-C在肺癌中有較高的表達率，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，提示VEGF-C與肺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移存在相關性，可作為評估肺癌進展客觀指標及預測肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的標志物。

[關鍵詞] 肺腫瘤；免疫組織化學；血管內(nèi)皮生長因子-C

[中圖分類號] R734.2[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）32-0051-03

目前在世界范圍內(nèi)，肺癌已成為癌癥死亡的主要原因，嚴重危害人類健康和生命[1]。肺癌死亡率仍高居癌癥死亡第一位，遠處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移嚴重影響患者預后，然而腫瘤的這種生物學特性仍是研究難題。VEGF-C作為fms樣酪氨酸激酶4的配體，傾向于擴散至淋巴系統(tǒng)，被認為是最具特異性的淋巴管生成調(diào)控因子。本研究采用免疫組化檢測非小細胞肺癌組織及正常組織中VEGF-C表達，分析其在NSCLC中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取浙江省臺州醫(yī)院2004～2007年70例NSCLC患者住院行肺癌根治術標本，男52例，女18例，年齡35～80歲；所有病例術前均未接受化療或放療。標本按WHO肺癌病理組織學分型：腺癌34例，鱗癌36例；組織分化程度：低分化27例，高中分化43例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。腫瘤TNM分期：T1期18例，T2期41例，T3期9例，T4期2例。N分期：N0期33例，N1期28例，N2期9例。另取距腫塊邊緣1.5 cm的癌旁組織19例，距腫塊邊緣5 cm正常肺組織20例。

1.2 實驗試劑與方法

兔抗人VEGF-C多克隆抗體購于美國INVITROGEN公司，Envision免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物公司。操作按試劑盒說明書進行，采用免疫組化Envision兩步法，用高壓熱修復法，以已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 分級標準

染色強度及細胞陽性范圍作為分級標準。細胞漿染色強度計分：無著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色為2分，棕褐色/胞漿內(nèi)棕黑色顆粒為3分；細胞陽性范圍計分：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再將染色強度與陽性細胞率作乘積分級：>3分為（+），6～9分為（++），9～12分為（+++），凡（+）及其以上者為陽性表達[2]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行χ2檢驗或四格表確切概率法，回歸分析采用Logistic回歸，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C染色結(jié)果

VEGF-C在不同肺組織中的表達見圖1。VEGF-C陽性染色為黃色、棕黃色、棕褐色，定位于細胞漿和/或膜上。VEGF-C在NSCLC中的陽性表達率為78.6%（55/70），在癌旁組織以及正常肺組織中的陽性表達率分別為31.6%（6/19）、10.0%（2/20），組間差異有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.2 VEGF-C的表達與NSCLC臨床病理特征的關系

VEGF-C在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性表達率為89.2%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C的陽性表達率為66.7%%；組間差異具有統(tǒng)計學意義。中高分化組和差分化組組間VEGF-C的陽性表達率分別為69.8%、92.6%，組間差異具有統(tǒng)計學意義；VEGF-C在肺鱗癌和肺腺癌中陽性表達率分別為66.7%、91.2%，組間差異具有統(tǒng)計學意義。VEGF-C在腫塊直徑≤3 cm的癌標本中陽性表達率為63.2%，在腫塊直徑>3 cm的癌標本中陽性表達率為84.3%，組間差異無統(tǒng)計學意義；VEGF-C在男性/女性患者的陽性表達率分別為80.8%和72.2%，差異無統(tǒng)計學意義；在>55歲或≤55歲的患者中，VEGF-C的陽性表達率分別為82.6%和70.8%，差異無統(tǒng)計學意義；VEGF-C在吸煙者和不吸煙者中陽性表達率分別為81.3%、72.7%，差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

2.3 VEGF-C表達與NSCLC臨床病理特征Logistic回歸分析

見表3。

將VEGF-C表達與各臨床病理特征進行Logistic回歸分析，全變量模型分析顯示組織學分化程度入選回歸方程（B=2.487，Exp（B）=12.030），對VEGF-C蛋白表達的影響具有統(tǒng)計學意義。采用向前逐步回歸模型（選入變量P ≤ 0.05，剔除變量P > 0.10）分析，組織學分化程度和腫瘤大小兩個變量入選回歸方程，對VEGF-C蛋白表達的影響具有統(tǒng)計學意義，Exp（B）分別為11.797、0.663，詳見表4。提示腫瘤的分化程度越低，腫瘤細胞表達VEGF-C水平越高；腫瘤大小的P < 0.05，但Exp（B）值靠近1，提示腫瘤大小與VEGF-C的表達可能無關。

3 討論

肺癌是嚴重危害人類生命和健康的常見疾病，發(fā)病率和死亡率逐年上升，而非小細胞肺癌為最常見的病理類型，占肺癌的80%。肺癌患者術后常出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，成為影響患者預后主要因素[3]。腫瘤生長依賴于新生脈管的形成，腫瘤血管、淋巴管生成及侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件。淋巴轉(zhuǎn)移是肺癌較為常見轉(zhuǎn)移途徑，隨著淋巴內(nèi)皮細胞標志物的發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移機制成為目前研究熱點。

VEGF-C作為VEGF的家族成員，研究認為與腫瘤淋巴管生成、生長和轉(zhuǎn)移密切相關，能增強腫瘤的淋巴管生成及侵襲能力，目前被認為是最具特異性的淋巴管生成調(diào)控因子。VEGF-C可與其受體VEGFR-3結(jié)合促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡并改變淋巴管生理特性。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表達與VEGFR-3的表達密切相關，促進外周新生淋巴管的生成。研究證實VEGF-C可以選擇性地誘導淋巴細胞存活，促進瘤周及瘤內(nèi)形成新的淋巴管，參與淋巴管的形成以及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。Veikkola等[5]通過轉(zhuǎn)基因小鼠研究證實VEGF-C和VEGF-D與其配體VEGFR-3結(jié)合，啟動VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信號通路，使得皮膚淋巴管增殖，而且在功能上新生的淋巴管與正常淋巴管具有相似性。

正常人體組織中，VEGF-C主要在成人的呼吸道及消化道黏膜的內(nèi)分泌細胞中有少量表達。目前研究證實諸如口腔癌、消化道腫瘤、肺癌、腎臟腫瘤、部分肉瘤、黑色素瘤、白血病細胞及乳腺癌組織等多種具有侵襲性的腫瘤組織細胞中存在VEGF-C表達。

研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ期NSCLC中VEGF-C的陽性表達促進淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移形成。在肺腺癌中VEGF-C的mRNA水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組呈現(xiàn)升高的趨勢。Ko等[6]研究報道VEGF-C在肺癌組織標本中陽性率為76.0%，且認為VEGF-C的陽性表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預后呈正相關。Li Q等[7]報道同樣認為肺癌中VEGF-C表達促使淋巴管新生，其表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，可作為肺癌進展客觀指標及預測肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的標志物。Ishii等[8]實驗表明高表達VEGF-C/VEGF-D的肺癌細胞株TKBS接種的裸鼠體內(nèi)局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移發(fā)生率遠高于正常對照組。

本實驗結(jié)果顯示NSCLC和癌旁組織、正常肺組織的VEGF-C的陽性表達率分別為78.6%、31.6%、10.0%，其檢驗差異明顯，提示VEGF-C在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要作用。根據(jù)單因素分析，VEGF-C在肺腺癌中的表達明顯高于肺鱗癌中表達，這與Ko等報道相一致。本研究中發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGF-C的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達，表明VEGF-C介導著腫瘤細胞淋巴轉(zhuǎn)移，在淋巴轉(zhuǎn)移途徑中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)代學利等[9]的研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C在肺腺癌病灶表達率（71.2%）明顯高于在肺鱗癌組（41.0%），腺癌病灶新生淋巴管密度（6.20±3.81）個明顯高于鱗癌組（3.95±3.18）個。結(jié)合本研究及臨床，這可能與肺腺癌極易早期出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移相關。單因素分析發(fā)現(xiàn)VEGF-C陽性表達與患者性別、年齡、腫塊大小、吸煙情況無統(tǒng)計學意義。本研究進一步采用了Logistic回歸分析，分析VEGF-C的表達與各臨床病理因素的相關性。結(jié)果表明在腫瘤組織分化程度間VEGF-C差異明顯，腫瘤組織分化程度是VEGF-C蛋白陽性表達的影響因素，分化程度越低，腫瘤細胞表達VEGF-C水平越高，說明VEGF-C與較高的惡性生物學行為有關。

上述研究結(jié)果表明，VEGF-C在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，提示VEGF-C可作為評估肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移客觀指標。

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（收稿日期：2012-08-22）