老年大鼠股骨頸骨折術后認知功能及Aβ1～40、Bax、Bcl-2的改變

凌云志 禹 莉 梁啟勝 李曉紅

(蚌埠醫學院第一附屬醫院麻醉科，安徽 蚌埠 233004)

術后認知功能障礙(POCD)是指手術后數天內發生的意識、認知、定向、思維、記憶以及睡眠等方面的紊亂，是老年患者術后早期較為顯著的問題〔1〕。Berggren等〔2〕發現老年患者股骨頸骨折固定術后POCD的發生率高達44%，POCD發病機制尚無定論。本實驗以股骨頸骨折的老年SD大鼠作為研究對象，旨在觀察股骨頸骨折麻醉術后對老年大鼠認知功能的影響及可能影響認知功能的指標，進一步探討POCD的發生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用18～20個月齡的健康清潔級SD大鼠35只，雌雄各半，體重450～500 g，由江蘇省實驗動物中心提供。實驗前12 h禁食不禁水。隨機分為3組:K組(n=7)為空白組，不做任何麻醉及手術處理;D組(n=14)為對照組，僅制作股骨頸骨折模型;S組(n=14)為手術組，制作股骨頸骨折模型，麻醉后行股骨頸骨折內固定術。D組、S組大鼠根據處理時間的不同各分為2個亞組，每組7只，分別為處理后1 d、3 d組(即 D1、D3 組;S1、S3 組)。

1.2 手術處理 老年大鼠左股骨頸骨折模型制作成功后，肌注氯胺酮90～100 mg/kg，待大鼠翻正反射消失后仰臥位固定，保持氣道通暢。切開右腹股溝皮膚，游離暴露股靜脈，然后進行小兒B-D套管針置管，建立靜脈通道，乳酸鈉林格注射液靜脈維持輸液，固定包埋套管針，縫合皮膚。常規消毒鋪巾，在左側股骨頸骨折部位，選擇后外切口，切開皮膚、筋膜，分離肌層，暴露骨折斷端，使用1.0 mm克氏針行骨折斷端交叉固定，徹底止血后，逐層關閉縫合傷口，青霉素鈉粉劑灑在傷口表面，術中呼吸平穩。術后傷口愈合好，分籠喂養，無手術死亡。

1.3 材料 大鼠Aβ1～40ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司);RT-PCR試劑盒(MBI Fermentas公司);Trizol試劑(Invitrogen公司)。

1.4 方法

1.4.1 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮為一直徑120 cm、高55 cm的圓形水池，水池內壁被漆為黑色，池內水深42 cm，水溫保持在(25±2)℃，房間內光照恒定，無光線反射在水池內，周圍參照物保持不變。池壁上以4個等距離點將水池分為四個象限，將平臺置于第四象限低于水面2 cm。各組大鼠均在術前3天開始Morris水迷宮學習，每天固定時間進行，選擇一個象限的固定位置將大鼠入水，以入水起至找到平臺的時間為潛伏期，如在120 s內未找到平臺，則潛伏期記為120 s。每天測試8次。第8次訓練時撤除平臺，然后在原入水點將大鼠面向池壁放入水中，測其在120 s內跨過原平臺所在位置的次數。第4天D組和S組制作股骨頸骨折模型，S組麻醉后行股骨頸骨折內固定術。術后1 d和3 d水迷宮測試時，手術切口用防水貼膜貼附，以防傷口進水引起感染。測試至完成均未發現傷口被大鼠咬噬裂開和感染，傷口愈合情況良好。

1.4.2 取材 水迷宮實驗完成后抽取大鼠心臟血液2 ml，放置30 min自然凝固后，3 000 r/min離心10 min，取上清，－20℃保存用于檢測血清Aβ1～40。斷頭處死，迅速開顱取腦，于冰臺上分離出海馬組織，－80℃凍存用于RT-PCR檢測。

1.4.3 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2 mRNA表達 參照Trizol試劑說明書提取組織總RNA。取3 ml總RNA為模板，用隨機引物逆轉錄合成cDNA，以此2 ml cDNA為模板，PCR擴增，所用引物見表1，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系終體積為25 ml，反應條件:95℃預變性3 min，94℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，36 個循環后 72℃平衡7 min，4℃保存。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Smart view圖像分析處理系統進行灰度掃描分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.5軟件分析，數據采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

表1 擴增目的基因及內參照的引物序列及產物長度

2 結果

2.1 水迷宮行為測試結果 D1、D3、S1、S3組大鼠逃避潛伏期與K組相比差異顯著(P＜0.01)，S1、S3組與D1組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)，S1、S3組與 D3組相比差異顯著(P＜0.01)。D1、D3、S1、S3組大鼠穿過原平臺的次數與K組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)，S1組與D1組相比差異顯著(P＜0.05)，S1、S3組與 D3組相比差異顯著(P＜0.05)，見表2。

2.2 血清Aβ1～40檢測 與K組相比〔(192.75±22.74)μg/L〕，D 組、S組血清 Aβ1～40濃度均升高(P ＜0.05)，以 D3組、S1組、S3組更為顯著〔(243.65±32.11)、(274.74±31.34)、(297.36±36.13)μg/L，(P ＜0.01)〕;與 D1組相比〔(232.71±27.62)μg/L〕，S1組、S3組差異顯著(P＜0.05);與D3組相比，S3組差異顯著(P＜0.01)。

表2 Morris水迷宮實驗結果(n=7

表2 Morris水迷宮實驗結果(n=7

與K組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 D1組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;與D3組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01，下表同

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2.3 半定量RT-PCR檢測結果 圖1，圖2為Bcl-2、Bax mR-NA表達的凝膠成像。電泳圖譜經光密度掃描分析，將各泳道灰度與GAPDH條帶灰度的比值作為Bcl-2、Bax mRNA的相對值。Bcl-2 mRNA的表達中，D1、D3、S1、S3組與K組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。Bax mRNA 表達中，S1、S3組與 K、D1、D3組相比差異顯著(P＜0.01)。Bcl-2/Bax值可見 D1、S1、S3組與K組相比差異顯著(P＜0.01)，S1、S3組與D1組相比差異顯著(P＜0.05)，S1、S3組與 D3組相比差異顯著(P＜0.01)，見表 3。

表3 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2 mRNA的表達(n=3

表3 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2 mRNA的表達(n=3

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3 討論

POCD是一種麻醉、手術后較為嚴重的神經系統并發癥，由于病因仍不很清楚，給臨床上預防和治療帶來一定困難。POCD在流行病學、病因學、發病機制、治療和預防等許多方面均存在許多未知領域，因此為了預防或減少老年病人POCD的發生，有必要深入探討POCD的具體發病機制，發現更多的與POCD聯系的標志分子，為POCD的預測、診斷和治療提供指標和方向。

Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關的空間學習記憶模型。逃逸潛伏期表明獲取空間信息的能力，而穿過原平臺的次數表明記憶貯存及提取再現能力。本研究提示老年大鼠股骨頸骨折術后空間辨別學習和記憶能力出現下降，行為學測試結果說明大鼠已出現明顯的認知功能障礙。

血漿Aβ水平是預測阿爾茨海默病(AD)發展和評價治療AD藥物療效的神經生化指標，是進行性認知功能障礙和記憶力減退的病理基礎〔3〕。Aβ是跨膜糖蛋白-淀粉樣β蛋白前體異常代謝的產物，分兩種類型:Aβ1～40和 Aβ1～42，Aβ1～40在腦脊液中占Aβ的90%，老年人和AD患者腦內Aβ1～40/Aβ1～42顯著升高〔4〕。說明老年大鼠股骨頸骨折術后認知功能下降可能與血清Aβ1～40濃度升高有關。

海馬是中樞神經系統中研究動物或人認知功能的經典腦區。既往研究報道大鼠認知功能受損與海馬神經元的凋亡有密切關系〔5〕。Bcl-2、Bax是有關細胞凋亡的重要調控基因，其中Bax是促凋亡基因，可使細胞器釋放出某些分子，引起半胱氨酸蛋白酶的活化，并拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡，或者通過啟動線粒體通透性轉變的方式誘導細胞凋亡〔6〕。Bcl-2編碼蛋白屬于線粒體膜蛋白，是重要的抗凋亡基因，又稱為“生存基因”，表達水平與細胞壽命呈正相關。Bcl-2和Bax可以形成異源二聚體，也可各自形成同源二聚體。Bcl-2/Bax值是一定的，這一比例的增大或減小會決定是誘導細胞凋亡還是抑制細胞凋亡〔7〕。本研究表明，老年大鼠在股骨頸骨折術后出現了短暫的認知功能障礙，血清Aβ1～40濃度升高以及海馬內Bcl-2/Bax比例降低導致的神經元損害可能與術后認知功能障礙有關。

1 Saravay SM，Kaplowitz M，Kurek J，et al.How do delirium and dementia increase length of stay of eldely general medical inpatients〔J〕?Psychosomatics，2004;45(3):235-42.

2 Berggren D，Gustafson Y，Eriksson B，et al.Postoperative confusion after anesthesia in elderly patients with femoral neck fractures〔J〕.Anesth Analg，1987;66(6):497-504.

3 Galvan V，Banwait S，Spilman P，et al.Interaction of ASK1 and the betaamyloid precursor protein in a stress-signaling complex〔J〕.Neurobiol Dis，2007;28(1):65-75.

4 范 隆，薛紀秀，王克杰，等.全麻老年患者圍術期血漿β-淀粉樣蛋白1-40的變化及其意義〔J〕.臨床麻醉學雜志，2008;24(10):843-5.

5 Yang TT，Hsu CT，Kuo YM.Cell-derived soluble oligomers of human amyloid-beta peptides disturb cellular homeostasis and induce apoptosis in primary hippocampal neurons〔J〕.JNeur Transm，2009;116(12):1561-9.

6 Marzo I，Brenner C，Zamzami N，et al.Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis〔J〕.Science，1998;281(5385):2027-31.

7 Gomes CC，Bernardes VF，Diniz MG，et al.Anti-apoptotic gene transcription signature of salivary gland neoplasms〔J〕.BMC Cancer，2012;12(1):61.