氯沙坦對血管性癡呆大鼠認知功能的改善及膽堿能系統活性的影響

陳江瑛等

[摘要] 目的 研究氯沙坦對血管性癡呆（VaD）大鼠認知功能的改善和膽堿能系統活性的影響。 方法 將40只雄性SD大鼠隨機分成四組：假手術組，模型組，氯沙坦低劑量[2 mg/（kg·d）]組，氯沙坦高劑量[5 mg/（kg·d）]組，每組10只。用雙側頸總動脈永久性結扎法（2VO）制備VaD大鼠模型，造模前予灌胃治療，Morris水迷宮測試治療后VaD大鼠認知功能的改善情況，Tunel染色測定各組大鼠海馬腦組織內細胞凋亡的變化。免疫組織化學方法檢測Bc1-2、Bax蛋白表達，并測定乙酰膽堿轉移酶（ChAT）活性。 結果 方差分析表明，潛伏期和跨越次數F值分別為33.23和25.20。氯沙坦灌胃治療的VaD大鼠，與未予治療的VaD大鼠組相比，治療組大鼠找到平臺的潛伏期縮短（P < 0.01），穿越平臺次數增多（P < 0.01）；氯沙坦高劑量組較氯沙坦低劑量組逃避潛伏期時間減少，穿越平臺次數增多（P < 0.01）。方差分析表明，凋亡細胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白F值分別為155.58、215.79和428.95。與模型組相比，氯沙坦治療組大鼠腦組織海馬區凋亡細胞數明顯減少，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著增加，凋亡基因Bax蛋白表達降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；氯沙坦高劑量組與氯沙坦低劑量組相比，Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。方差分析表明，各組大鼠ChAT活力F值為13.61。氯沙坦治療組腦組織ChAT活力明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；氯沙坦高劑量組與氯沙坦低劑量組相比，腦組織ChAT活力顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 氯沙坦治療可以明顯改善VaD大鼠的認知功能，其機制與調節凋亡相關蛋白的表達、促進乙酰膽堿的合成相關。

[關鍵詞] 氯沙坦；血管性癡呆；認知功能；細胞凋亡；乙酰膽堿轉移酶

[中圖分類號] R749.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）01（a）-0010-04

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性腦血管病等）導致腦組織損害，引起以認知功能障礙為特征的綜合征[1-2]。有研究表明，腦內具有獨立的腎素-血管緊張素系統（RAS），而RAS除調節血壓和水電解質平衡外，還參與學習、記憶等認知功能的調節。氯沙坦屬血管緊張素1型受體（AT1受體）阻滯藥，通過阻滯AT1受體對抗AngⅡ的作用。有研究顯示氯沙坦可進入腦組織，拮抗腦局部AT1受體，下調腦局部RAS系統的作用而產生腦保護[3-4]。本研究采用VaD模型大鼠，觀察氯沙坦對VaD大鼠認知功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 老齡健康雄性SD大鼠40只，月齡大于16個月，體重300～450 g，由中山大學北校區實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物 氯沙坦（美國杭州默沙東公司生產，批號：H20030654）。

1.1.3 試劑 凋亡TUNEL試劑盒（美國ROSS公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗體（美國Epitomics公司），兔抗大鼠BCl-2多克隆抗體（美國CST公司），乙酰膽堿轉移酶（ChAT）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 血管性癡呆大鼠模型的建立及分組處理

將雄性SD大鼠用10%水合氯醛（0.035 mL/10 g）腹腔注射麻醉后，分離雙側頸總動脈，并以“0”號絲線阻斷血流20 min，可以觀察到大鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快；同時在距鼠尾尖約1 cm處斷尾，放血約0.3 mL。松開絲線扣恢復血流10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復3次，第3次血流再灌注后觀察30 min，如大鼠呼吸、心跳平穩，即可縫合皮膚，放回籠中正常飼養。其中假手術組僅分離雙側頸總動脈，套絲扣；但不阻斷血流，尾部不放血，觀察時間、飼養條件與模型組相同。

造模前大鼠隨機分成四組，每組各10只：假手術組，模型組，氯沙坦低劑量[2 mg/（kg·d）]組，氯沙坦高劑量[5 mg/（kg·d）]組。手術當天提前2 h灌胃，直至術后15 d。在灌胃后30 d，分別對上述各組大鼠進行水迷宮試驗，觀察各組大鼠學習和記憶成績。術中假手術組大鼠無死亡，其余各組各有1只大鼠死亡。

1.3 Morris水迷宮測試

1.3.1 定位航行試驗 水溫控制在25℃左右，每日上下午各4次，將大鼠面向池壁分四個象限放入水中，記錄其在2 min內尋找到平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內未找到平臺，則用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留20 s，再放回籠中，其潛伏期算120 s。歷時5 d。

1.3.2 空間探索試驗 第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入，記錄其2 min內跨越原平臺位置的次數。

1.4 免疫組織化學法檢測Bcl-2、Bax陽性細胞的表達

各組大鼠在行為測試完畢后以10%水合氯醛麻醉，立即開胸暴露心臟，左心室迅速插管至主動脈，同時剪開右心耳，灌注生理鹽水100 mL，再灌注4%的多聚甲醛250 mL，速度先快后慢，至頸部非常僵硬為滿意，迅速取腦并分離左側海馬區組織，4%多聚甲醛中浸置4～6 h，經乙醇常規脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 μm厚切片，行免疫組化染色，嚴格按照說明操作。

1.5 氯沙坦對乙酰膽堿轉移酶活力的影響

將上述各動物實驗，選取6只不同劑量組的大鼠斷頭處死，制成10%的勻漿，采用相關試劑盒測定腦組織中ChAT的活力。

1.6 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較

模型組所用逃避潛伏期時間明顯長于假手術組、氯沙坦高劑量組及氯沙坦低劑量組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）?？臻g探索試驗結果顯示，氯沙坦高劑量組、低劑量組出現穿越平臺次數均高于模型組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。氯沙坦高劑量組出現穿越平臺次數高于氯沙坦低劑量組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 氯沙坦對大鼠凋亡細胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的影響

與假手術組比較，模型組凋亡基因Bax蛋白表達顯著增加（P < 0.01），抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著下降（P < 0.01）。與模型組比較，氯沙坦低劑量組、氯沙坦高劑量組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著增加（P < 0.01），凋亡基因Bax蛋白表達降低（P < 0.01）。說明氯沙坦可能通過影響凋亡相關蛋白的表達而發揮神經保護作用。氯沙坦高劑量組與低劑量組比較，Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 氯沙坦對大鼠腦組織中膽堿乙酰轉移酶活力的影響

與假手術組比較，模型組腦組織ChAT活力顯著降低（P < 0.01），氯沙坦低、高劑量組腦組織ChAT活力明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。氯沙坦高劑量組與低劑量組比較，ChAT活力差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

中樞膽堿能機制和缺血后遲發性神經元死亡（DND）引起的炎癥反應、細胞凋亡是近年研究較為重視VaD的發生機制[5]。中樞膽堿能通路是構成學習記憶的主要通路，乙酰膽堿（ACh）是其中的重要神經遞質，其濃度升高有利于學習記憶能力的恢復，降低則促進癡呆的發生[6]。腦缺血時膽堿能神經元退變，分解ACh增強，導致ACh濃度降低從而促進癡呆的發生。ChAT活性被視為膽堿能神經元最具體的指標，ChAT活性降低的程度以及由此產生的ACh水平下降的嚴重程度與認知能力下降密切相關，與年齡相關的認知功能障礙在動物大腦中表現出ChAT活性顯著降低[7]。海馬CA1區對腦缺血有選擇易損性，海馬神經元的凋亡丟失和缺血壞死影響了神經元突觸的可塑性，影響了海馬對信息的處理和傳遞，引起腦缺血后記憶認知功能損害。

近年的研究證實[8-10]，應用血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）阻斷劑減少AngⅡ的生成或阻斷其受體信號通路，能明顯改善腦血流量和認知功能。Rozzini等[11]研究證實，卡托普利可以改善缺血性腦梗死患者的生活質量，提高其認知功能。推測其機制可能與卡托普利通過抑制腦源性AngⅡ的生成，間接提高腦組織ACh的濃度，從而改善認知功能有關。Moretti等[12]研究發現，腦室內注入煙堿類膽堿能受體拮抗劑美加明可破壞雄性SD大鼠的空間學習能力， 再注AngⅣ可使其受損的空間學習能力恢復正常。說明AngⅣ對學習記憶的修復作用與腦中的膽堿能系統相關。

在本實驗中，采用氯沙坦對血管性癡呆大鼠進行治療，可明顯改善大鼠搜索平臺的潛伏期和跨越平臺的次數，改善大鼠學習記憶功能。在實驗中，VaD模型組大鼠CA1區Bax高表達，Bcl-2低表達，凋亡細胞增多，證實了長期低灌注可使海馬神經元凋亡，影響認知和記憶。氯沙坦低劑量組和高劑量組與模型組相比，均有Bcl-2的高表達，Bax的低表達，凋亡細胞也明顯減少。說明氯沙坦能抑制海馬神經元細胞的凋亡，達到保護神經元，改善VD大鼠學習記憶能力的效果，其機制與調節凋亡相關蛋白的表達相關。同時，氯沙坦可以有效提高ChAT活性，明顯改善模型小鼠學習記憶能力，提示氯沙坦可促進ACh的合成，增加ACh與M受體的結合，這可能也是氯沙坦增強模型小鼠學習記憶功能的機制之一。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-10-28 本文編輯：張瑜杰）