雄激素調節耐多西他賽前列腺癌細胞肺耐藥蛋白的表達

蔣照輝　李和明　蔣軍輝等

[摘要] 目的 腫瘤多藥耐藥是導致腫瘤化療失敗的主要原因，肺耐藥蛋白（LRP）可誘導多藥耐藥，我們研究雄激素對前列腺癌的LRP表達影響。 方法 人前列腺癌細胞株LNCaP及PC-3在含多西他賽的培養液中誘導成為耐藥細胞株，耐藥細胞株分別在含有DHT培養液和在含DHT及比卡魯胺培養液中培養7d。免疫細胞化學及Western Blot檢測兩組細胞的LRP表達。 結果 LRP在LNCaP及PC-3細胞系的表達明顯低于LNCaP/Docetaxel及PC-3/Docetaxel細胞系，DHT誘導后，LNCaP/Docetaxel及PC-3/Docetaxel細胞系的LRP表達明顯增加，經DHT及比卡魯胺聯合作用后，LRP的表達明顯低于DHT誘導后。 結論 多西他賽可誘導前列腺癌LRP表達， 二氫睪酮可誘導耐多西他賽前列腺癌的LRP增量表達，雄激素受體阻斷劑比卡魯胺可阻斷二氫睪酮的誘導作用。

[關鍵詞] 雄激素；前列腺癌；多藥耐藥；肺耐藥蛋白

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）04-0017-03

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家前列腺癌的發病率已經超過肺癌，成為發病率最高的惡性腫瘤，雖然我國前列腺癌的發病率低于歐美國家，但近年來呈現上升趨勢。

內分泌治療是晚期前列腺癌的主要治療方法，大多數前列腺癌患者起初對內分泌治療均有效，但經過中位時間14～30個月后，幾乎所有前列腺癌都將逐漸發展為激素難治性前列腺癌。目前以多西他賽為基礎的化療已經成為激素難治性前列腺癌標準的一線治療方案，病情緩解期為4～10個月，中位數生存時間為9～18個月。腫瘤多藥耐藥是腫瘤化療失敗的主要原因，肺耐藥蛋白（LRP）是目前研究較多的腫瘤耐藥相關蛋白，但在前列腺癌中的表達只有很少報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人前列腺癌細胞株LNCaP及PC-3（中科院上海細胞庫），RPMI-1640培養液（Sigma 公司），LRP抗體IgG（Santa Cruz公司），PVDF膜（Millipore公司）， 多西他賽（江蘇恒瑞醫藥公司，批號201209304），二氫睪酮DHT（Sigma 公司），比卡魯胺（康為世紀公司）。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1雄激素對耐多西他賽難治性前列腺癌細胞株的誘導 人前列腺癌細胞株LNCaP及PC-3分別培養于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 mg/L的RPMI-1640培養液中， 0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集生長旺盛的細胞用于實驗。含多西他賽濃度0.8μg/mL（1/5治療劑量的血藥濃度），與LNCaP及PC-3細胞共同培養7 d，每7天增加多西他賽濃度0.8μg/mL， 直至在含多西他賽濃度4μg/mL（正常治療劑量的血藥濃度）的RPMI-1640培養液中，細胞能穩定生長傳代，建立LNCaP及PC-3耐多西他賽細胞系（LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel）。將LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel分為兩組，一組細胞在含有100nmol/L DHT的RPMI-1640培養液中培養7d建立LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT細胞株，另一組在含100nmol/L DHT及1μg/L比卡魯胺RPMI-1640培養液中培養7d建立LNCaP/docetaxel-DHT-比卡魯胺及PC-3/Docetaxel-DHT-比卡魯胺細胞株。

1.2.2 LRP的免疫細胞化學 將LNCaP及PC-3、LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel、LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT、LNCaP/docetaxel-DHT-比卡魯胺及PC-3/Docetaxel-DHT-比卡魯胺分別接種于盛有蓋玻片的24孔板中，細胞爬滿蓋玻片后，取出蓋玻片用4%多聚甲醛4℃固定15min，PBS洗3次，20%正常羊血清室溫孵育30min，分別加入LRP鼠單克隆抗體IgG（1∶1000），37℃ 2h，PBS 洗3次，EnVision試劑（HRP/R）37℃30min，DAB顯色12min，蘇木精染色，樹脂封片；顯微鏡下觀察，背景呈紫藍色，陽性產物呈棕黃色或黃色。圖像應用圖像分析軟件分析。

1.2.3 Western Blot 檢測LRP表達 用蛋白裂解液于冰浴裂解LNCaP及PC-3、LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel、LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT、LNCaP/docetaxel-DHT-比卡魯胺及PC-3/docetaxel-DHT-比卡魯胺細胞15min，14 000 ×g，離心15min。取上清液移入新的離心管中-80℃保存待用。取少量上清按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟進行定量。100℃煮沸變性10min，冰浴5min后上樣。取出上樣至0.5mL進行電泳，電泳時間一般4h，電壓60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。取下PVDF膜，置于濕盒中用5%BSA封閉2h，加入LRP鼠單克隆抗體（1∶1000），4℃搖床過夜，PBS洗15min×3，加入兔抗鼠二抗（1∶5000），室溫，反應1h，混合等體積化學發光劑AB液，放射自顯影，放入Bio-Rad化學發光儀檢測結果定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0 統計學軟件，等級資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LRP表達細胞免疫結果

LRP主要表達在細胞胞漿，LNCaP及PC-3細胞系LRP的表達強度為+（15/100、9/100），明顯低于LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細胞系表達強度++（45/100、38/100）（χ2=6.134，P=0.043；χ2=5.367，P=0.048）；DHT誘導后LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細胞系LRP的表達強度為+++（78/100、70/100）（χ2=7.456，P=0.031；χ2=7.123，P=0.034），比卡魯胺阻斷DHT后LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細胞系LRP的表達強度++（42/100、22/100）（χ2=7.986，P=0.028；χ2=7.363，P=0.030）。

2.2 Western blot 結果

LRP在LNCaP及PC-3細胞系的表達明顯低于LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細胞系，DHT誘導后， LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細胞系的LRP表達明顯增加，經DHT及比卡魯胺聯合作用后，LRP的表達明顯低于DHT誘導后（圖1）。

3 討論

近年來我國前列腺癌的發生率呈現上升趨勢，發現時多數為晚期，雄激素阻斷是晚期前列腺癌的主要治療方法，起初大多數患者對雄激素阻斷治療有效，但經過14～30個月后，幾乎所有患者病變都將逐漸發展為激素難治性前列腺癌。目前以多西他賽為基礎的化療已經成為激素難治性前列腺癌的標準一線治療方案，但化療的有效緩解期為4～10個月，并逐漸發展為對多種化療藥物產生耐藥，從而導致治療失敗。

腫瘤出現多藥耐藥的原因為腫瘤本身固有的耐藥現象和經化療藥物誘導產生的耐藥能力。肺耐藥相關蛋白（LRP）是Scheper等[1]在肺癌中首先發現，LRP過度表達在許多實體腫瘤和腫瘤細胞株中發現[2-4]。LRP在細胞中參與藥物的囊泡運輸，可把細胞核內的藥物轉運至核外，形成囊泡包裹藥物，使化療藥物不能發揮作用，并胞吐排出細胞，從而介導多種化療藥物的耐藥。Kerr 等[5]報道LRP高表達容易導致卵巢漿液性癌對卡鉑耐藥。Tsuji報道LRP的表達是白血病母細胞誘導化療抵抗的一個危險因素，抑制LRP表達可有效增加化療效果[6]。律潔等[7]報道抑制A549/DDP細胞中Src酪氨酸激酶活性可降低細胞LPP表達，從而逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性。李祥春等[8]報道塞來昔布可以下調胃癌細胞株中耐藥基因LRP的表達，逆轉多藥耐藥作用。

劉津等[9]報道人鼻咽癌多藥耐藥細胞株LRP在蛋白水平及mRNA水平的表達高于親本細胞，表明LRP的表達上調與其耐藥機制有密切關系。韓冰等[10]報道氟尿苷耐藥絨癌細胞系LRP基因的表達隨著誘導藥物濃度和腫瘤細胞耐藥性的增加而逐漸上調。我們發現LNCaP及PC-3前列腺癌細胞株均有不同水平的LRP表達，而經過多西他賽誘導后LRP表達明顯增加。我們的結果提示多西他賽治療一段時間后，可誘導耐藥蛋白LRP表達，從而使前列腺癌細胞獲得繼發性耐藥。這結果表明，前列腺癌細胞株LNCaP及PC-3通過LRP的表達，即有部分的耐藥能力，通過多西他賽的誘導后，LRP可表達增加，前列腺癌耐藥可能同時具有繼發性和原發性耐藥，導致化療失敗。

曾有報道提示雄激素可加快前列腺癌多藥耐藥的發生，雄激素受體阻斷劑可部分糾正雄激素的誘導多藥耐藥的作用[11，12]，Ho[13]報道雄激素可增加多藥耐藥蛋白4（MRP4）的表達，而氟他胺可阻斷雄激素的誘導作用。王素霞等[14]報道在乳腺癌中雌激素受體表達與肺耐藥相關蛋白成正相關。Wartenberg[15]報道外源性丙酮酸可誘導前列腺癌細胞DU145的P-gp表達，加快細胞表柔比星外排，從而逆轉腫瘤細胞耐藥。我們發現耐多西他賽的人前列腺癌細胞株LNCaP及PC-3經二氫睪酮誘導后，LRP表達明顯增加，而通過比卡魯胺阻斷雄激素受體后，比卡魯胺可阻斷二氫睪酮的LRP表達。

綜上所述，耐多西他賽誘導前列腺癌的耐藥相關蛋白LRP表達增加，而二氫睪酮可誘導耐多西他賽前列腺癌的耐藥相關蛋白LRP增量表達，雄激素受體阻斷劑比卡魯胺可阻斷二氫睪酮的誘導作用，提示在臨床晚期前列腺癌化療時保持去勢狀態，可減少前列腺癌多藥耐藥的產生。

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（收稿日期：2013-10-31）

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（收稿日期：2013-10-31）