放射性肺損傷中核因子κB和細胞間黏附分子1的表達及意義

張振勇，曹秋婷，吳榮

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院腫瘤科，沈陽110022；2.大連大學附屬新華醫院腫瘤科，遼寧大連116021）

放射性肺損傷中核因子κB和細胞間黏附分子1的表達及意義

張振勇1，曹秋婷2，吳榮1

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院腫瘤科，沈陽110022；2.大連大學附屬新華醫院腫瘤科，遼寧大連116021）

目的探討放射性肺損傷中核因子κB（NF-κB）、細胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達情況及其在放射性肺損傷發生發展過程中的作用機制。方法實驗對象為Wistar大鼠，照射組接受X線照射（分為15 Gy照射組和20 Gy照射組），未照射組不接受照射。照射后飼養28 d，通過免疫組化法測定NF-κB和ICAM-1的表達，免疫組化染色利用計算機圖像分析系統進行定量測定。結果NF-κB在未照射組少量表達，在15 Gy照射組和20 Gy照射組中表達均增強，與未照射組相比差異均有統計學意義（均P＜0.001），且2個照射組比較NF-κB表達的差異有統計學意義（P＜0.001）。未照射組ICAM-1幾乎不表達，15 Gy照射組和20 Gy照射組與未照射組相比ICAM-1表達增強，差異均有統計學意義（均P＜0.001），但2個照射組比較ICAM-1表達無統計學差異（P＞0.05）。結論NF-κB和ICAM-1是導致急性放射性肺損傷的重要因素。通過減少NF-κB的活化調控ICAM-1的表達，可能減少放射性肺損傷，這為放射性肺損傷的預防和治療可能提供新的治療靶點。

核因子κB；細胞間黏附分子1；放射性肺損傷

放射治療目前仍是治療腫瘤的主要手段之一，應用放療治療胸部腫瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等時，正常的肺組織均會或多或少的受到一定劑量的照射而造成一定程度的放射性肺損傷，通常為降低這種放射性肺損傷的發生率，腫瘤靶區劑量會受到一定的影響。放射性肺損傷主要有放射性肺纖維化和放射性肺炎兩種。但由于發生機制不明和治療方法有限，放射性肺損傷成為胸部放療的主要限制性因素，因此放射性肺損傷發病機制的研究及治療靶點的探索具有重要意義。

研究顯示，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種控制編碼細胞因子、細胞黏附分子、疾病和

健康狀態下一些基因表達的轉錄因子。越來越多的研究證據表明NF-κB極易被輻射激活，同時也顯示著它與放射性損傷有著密切的關系［1］。細胞間黏附因子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是近年來在炎性反應過程中發現的細胞與細胞之間扮演中介角色的細胞因子，在放射性肺損傷過程中也擔任非常重要的角色。本研究以大鼠接受不同劑量照射建立動物模型，觀察NF-κB與ICAM-1在放射性肺損傷過程中的表達，為揭示放射性肺損傷的發病機制和治療措施提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：健康雌性Wistar大鼠（SPF級）40只（由中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心代購），月齡為3個月，體質量180～220 g。所有大鼠均飼養在中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心P3實驗室屏障系統中，按照中國醫科大學動物中心有關標準飼養、管理。

主要儀器、設備及試劑：彩色超聲診斷儀EUB-8500（日本日立公司），醫用直線加速器（德國西門子公司），光學顯微鏡BX50（日本OLYMPUS公司），病理圖像分析儀HPIAS-100（西安華海電子有限公司），生物組織石蠟包埋機TEC-2800型（意大利郝思琳），石蠟切片機RY-2235（德國LEICA公司），二步法免疫組織化學檢測試劑（北京中杉金橋生物技術有限公司），NF-κB多克隆抗體（美國Santa Cruze公司），ICAM-1兔IgG多克隆抗體（即用型，博士德生物工程有限公司），免疫組化染色試劑盒（即用型SABC，博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組干預：將Wistar大鼠隨機分成未照射組（10只）、15 Gy照射組（15只）和20 Gy照射組（15只）。照射組照射前用10%水合氯醛將大鼠進行腹腔麻醉（劑量0.3 mL/100 mg），在鼠板上仰臥固定，醫用直線加速器調至10 MeV X線進行右全肺照射，單野，射野范圍2 cm×2 cm，源皮距為100 cm，左胸及身體其余部位裝置鉛擋。照射后大鼠自然蘇醒。未照射組僅麻醉。

1.2.2 標本的制備：大鼠照射后飼養28 d，最后存活的大鼠數量為未照射組10只、15 Gy照射組13只、20 Gy照射組12只，將大鼠斷頸法處死，取右肺葉組織以甲醛固定，-80℃冰箱儲存備用，48 h后將固定的組織放入70%乙醇溶液中。將保存在乙醇中的組織取出，取約10 g大小組織放入包埋盒中。在自動脫水機中脫水，完全脫水后經石蠟透明。然后放入制模鐵片上，用石蠟機完全包埋、填充，靜置于室溫1 h，存貯于-20℃冰箱2 h后置于切片機上輕輕切片，將石蠟薄片浸于水中完全舒展后，置于烤箱中干燥1～2 h。

1.2.3 免疫組化染色：將切片脫蠟后用蒸餾水洗2 min再用PBS液洗3次，3%H2O2室溫浸泡10 min后用PBS液洗3次，高壓高溫抗原修復10 min冷卻，再用10%血清封閉30 min。待將血清甩掉，加第一抗體（1∶200稀釋）1滴，4℃放置過夜。PBS液洗3次后加第二抗體1滴，室溫放置30 min。繼續用PBS液洗3次。加SABC 1滴，放置室溫30 min。甩掉SABC后用PBS液洗3次。加DAB 1滴后置于顯微鏡下，見染色后繼續用PBS液洗后用蘇木素復染，流水返藍后用梯度乙醇及二甲苯脫水，樹膠封片。

1.2.4 光鏡下觀察結果：細胞質/核染成棕黃色或黃色為免疫組化陽性。每個實驗組每個動物選取染色好的切片1張，隨機在每張切片上選取視野7個，采用圖像分析儀分別測定NF-κB及ICAM-1的平均光密度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 NF-κB的表達情況

免疫組化染色發現，未照射組中細胞質/核染成黃色或棕黃色的細胞較少，提示NF-κB有少量表達；15 Gy照射組與20 Gy照射組可見大量細胞質/核染成棕黃色，提示NF-κB表達均增強。見圖1。

2.2 NF-κB表達的定量測定

未照射組、15 Gy照射組、20 Gy照射組NF-κB光密度值分別為0.085±0.004、0.191±0.031、0.235± 0.009。15 Gy照射組、20 Gy照射組與未照射組相比，NF-κB光密度值的差異均有統計學意義（P＜0.001），并且2個照射組相比NF-κB光密度值也有統計學差異（P＜0.001）。

2.3 ICAM-1的表達情況

免疫組化染色發現，未照射組少有細胞質/核黃染，提示ICAM-1在正常肺泡組織中幾乎不表達。

15 Gy照射組和20 Gy照射組可見細胞質/核染成棕黃色，提示ICAM-1表達均增強。見圖2。

2.4 ICAM-1表達的定量測定

未照射組、15 Gy照射組、20 Gy照射組ICAM-1光密度值分別為0.085±0.004、0.230±0.019、0.234± 0.017。15 Gy照射組、20 Gy照射組與未照射組相比，ICAM-1光密度值的差異均有統計學意義（P＜0.001），但2個照射組相比ICAM-1光密度值無統計學差異（P＞0.05）。

圖1 免疫組化染色檢測各組大鼠NF?κB的表達×40Fig.1 NF?κB expression in each group detected by immunohistochemical staining×40

圖2 免疫組化染色檢測各組大鼠ICAM?1的表達×40Fig.2 ICAM?1 expression in each group detected by immunohistochemical staining×40

3 討論

放射性肺損傷分為早期損傷和晚期損傷。美國放射腫瘤治療協作組將發生在放療開始后90 d內的放射損傷稱為急性放射損傷，超過90 d發生的稱為晚期放射損傷。早期放射性肺損傷主要為放射性肺炎，是一種由免疫介導的以淋巴細胞性肺泡炎為主的局部放射反應。晚期放射性肺損傷主要為放射性纖維化，是因靶細胞損傷后釋放多種細胞因子，啟動成纖維細胞進行增殖，導致膠原蛋白大量合成，最終使大量膠原沉積在肺間質［2］。研究顯示，大鼠肺組織接受15～20 Gy劑量照射，8～12周后會產生放射性損傷的系列改變［3］，這些變化可能與受照體積、受照部位、放射劑量、放療時間等都有關。放射肺損傷的機制研究開始于上世紀50年代，主要學說有肺泡上皮損傷、肺泡巨噬細胞生長因子、肺血管平滑肌損傷、淋巴管受累、免疫反應、巨細胞病毒參與等［4，5］。目前認為放射性肺損傷是一個復雜的病理生理過程，多種細胞因子在放射性肺炎和肺纖維化的發生發展中起調控作用。

近幾年發現NF-κB是一個多功能核轉錄因子，生物學活性廣泛，極易被激活，如腫瘤壞死因子α、免疫球蛋白G、射線、毒素等，激活后的NF-κB又可促進多種炎性介質如細胞因子、黏附分子、趨化因子等轉錄，并參與多種細胞因子、趨化因子和促纖維因子的合成，以及細胞外基質交聯、成纖維細胞的分化和細胞增殖過程［6］，從而在炎性反應中發揮重要角色。NF-κB有5種不同的二聚體形式，不同的二聚體具有不同的結合序列，從而具有不同的功能特性［7］。在絕大多數靜止期的細胞中，NF-κB以非活性形式存在于細胞質中，并可被許多刺激物所激活?，F今越來越多的研究證據證明輻射可以激活NF-κB，這可能與放射性肺損傷關系密切，也可能刺激前炎性因子在放射性肺損傷過程中產生作用。Sherman等［8］、Brach等［9］研究先后顯示了輻射可以激活TNF基因，進而在NF-κB的激活過程中起重要的作用。本研究中也顯示，大鼠肺組織分別接受15 Gy、20 Gy放射線照射后，肺組織中的NF-κB被激活，較未照射組表達增多，表達水平存在統計學差異。Haase等［10］研究還顯示照射劑量增大后的鼠肺中NF-κB的表達增高達6個月以上，因此認為這可能與后期的慢性炎癥和間質細胞纖維化有關。

對肺間質纖維化的發病機制目前公認為：（1）早期各種外源性或內源性刺激引起大量炎性細胞聚集后滲出到肺泡腔、肺間質中，從而參與了肺損傷［11］；（2）其后炎性細胞和肺細胞分泌大量致纖維化因子，導致纖維組織增生，肺泡結構毀損。在這個過程中，不同細胞之間及細胞與基質之間的相互作用尤其重要，而黏附分子在它們中扮演著橋梁的角色［12］。黏附分子可以使細胞與細胞之間或細胞與基質之間更易于接觸和結合，繼而參與細胞的信號轉導、生長等一系列重要病理生理過程。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，主要存在于肺組織的肺泡上皮和毛細血管內皮上，肺間質纖維化時，在炎性介質作用下，通過CD11/CD18-ICAM-1途徑，可黏附白細胞使CD11/CD18表達上調，內皮細胞上ICAM-1表達亦上調［13］，故而能加重肺損傷。輻射可誘導肺血管內皮細胞產生ICAM-1，趨化白細胞黏附于內皮細胞，導致炎性反應。本研究結果提示，正常大鼠肺組織中ICAM-1表達呈陰性或弱陽性，接受照射后ICAM-1在肺組織中表達增強，但與劑量關系不大，即低劑量照射組與高劑量照射組之間光密度值無統計學差異。但這仍表明ICAM-1與肺損傷的炎性反應密切相關。目前，黏附因子參與肺纖維化的作用機制尚不明確。據免疫組化測定ICAM-1表達結果推測，ICAM-1可能參與肺間質纖維化形成。有研究利用博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型［14］，并從中發現白細胞的累積水平與肺組織纖維化程度相關，而L-選擇素、ICAM-1可介導白細胞聚集，進而調節炎性細胞因子的產生［15］。所以說ICAM-1在肺纖維化發展中的扮演著一個復雜的角色。

也有研究提示了某些組織中NF-κB活性的改變與ICAM-1表達相關［16］，在基礎狀態下少量NF-κB被刺激后激活，而ICAM-1的表達變化又與之同步。所以我們猜測，在放射性肺損傷中NF-κB很可能在基因轉錄水平上對ICAM-1的表達起著調控作用，從而影響其后的一系列炎癥發展過程。雖然NF-κB對ICAM-1表達調控的具體機制還有待于進一步研究，但我們推測通過NF-κB抑制劑減少NF-κB的活化后，既可以減少NF-κB調控下的相關炎性反應，也可以調控ICAM-1的表達，以減輕肺泡炎性反應，進而減少肺組織損傷。這將是我們研究的新方向，給與此相關的疾病提供了一個新的治療靶位。

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（編輯 陳姜）

Expression and Significance of Nuclear Factor-κBand Intercellular Adhesion Molecule-1 in Radiation-induced Lung Injury

ZHANGZhen-yong1，CAOQiu-ting2，WURong1
（1.Department of Medical Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China；2.Department of Oncology，Xinhua Hospital Affiliated Dalian University，Dalian 116021，China）

ObjectiveTo discuss the expression ofnuclearfactor-κB（NF-κB）and intercellularadhesion molecule-1（ICAM-1）in radiationinduced lung injury，and their mechanisms in the genesis and development of radiation-induced lung injury.MethodsWistar rats were used in the experiment.Rats in treatment groups received X-ray irradiation（15 Gy irradiation group and 20 Gy irradiation group），whereas those in the nonirradiated group did not.After28 days，NF-κB and ICAM-1 expression in the radioactive lung injury in rats was tested using immunohistochemistry，and immunohistochemicalstaining was quantitatively determined using the computerimage analysis system.ResultsNF-κBexpression in the nonirradiated group was a little，and itincreased in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups.The difference in the NF-κB expression between the irradiated and non-irradiated groups was statistically significant（P＜0.001）；and that between the two irradiation groups was also statistically significant（P＜0.001）.ICAM-1 expression was little in the non-irradiated group；however，it increased in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups.The differences in the ICAM-1 expression in the 15 Gy and 20 Gy irradiation groups were statistically significant compared with that in the non-irradiated group（P＜0.001）.However，the difference in ICAM-1 expression between the two irradiation groups were statistically non-significant（P＜0.05）.ConclusionNF-κB and ICAM-1 are the key factors that lead to acute radiation-induced lung injury.By reducing NF-κB activity and regulating ICAM-1 expression，radiation-induced lung injury can be reduced，which provides a new therapeutic targetforthe prevention and treatmentofradiation-induced lung injury.

nuclear factor-κB；intercellular adhesion molecule-1；radiation-induced lung injury

R818.74

A

0258-4646（2014）02-0155-04

張振勇（1977-），男，主治醫師，碩士.通信作者：吳榮，E-mail：wur@sj-hospital.org

2013-11-13

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