北五味子總木脂素減輕內質網途徑凋亡延緩小鼠腦衰老*

于春艷， 于春榮， 李 賀， 鞠文博， 姜恩平, 4△，陳建光△

(1北華大學基礎醫學院，吉林 吉林 132013； 2北京昭衍新藥研究中心股份有限公司毒理部，北京 100176； 3北華大學藥學院，吉林 吉林 132013； 4廣東醫學院, 廣東 東莞 523808)

隨著人們年齡的增長、老齡人口的增多，研究衰老的機制以及如何緩解衰老引起學者們越來越多的關注。腦衰老是人衰老最明顯的現象，腦衰老的過程極其復雜，研究認為腦組織結構與功能的改變由多種因素共同作用導致，學習和記憶能力的減退是最重要的表現[1]。北五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill]屬木蘭科植物，據報道其中有效成分五味子多糖可使衰老小鼠已退行性變的神經細胞恢復正常，且可使神經細胞胞體增大并可明顯促進衰老小鼠神經細胞的發育[2]。北五味子是否具有緩解腦衰老作用尚需進一步研究。關于衰老的發生機制有許多學說，如自由基學說、端粒學說和細胞凋亡學說等[3]。研究發現，在細胞水平，衰老主要體現在細胞膜流動性降低、脂褐質色素累積、酶活性下降和蛋白質聚集體增加等[4]。內質網是細胞內最重要的負責蛋白質折疊的細胞器，未折疊蛋白或錯誤折疊的蛋白在內質網內堆積即發生內質網應激。持續的內質網應激會誘導細胞發生凋亡[5]。本課題組已利用D-半乳糖復制小鼠衰老模型，給予不同劑量的北五味子總木脂素(schisandra total lignin，SCL)，結果顯示北五味子總木脂素給藥組延緩小鼠衰老，并增加衰老小鼠肌肉協調性、增強衰老小鼠學習記憶能力[6]，此次實驗觀察代表蛋白聚集物堆積的泛素化蛋白(ubiquitin，Ub)的表達水平以及葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、硫氧還蛋白二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase,PDI)和C/EBP同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)表達水平的變化，凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達情況，用以明確北五味子總木脂素抗衰老作用及其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 試劑

北五味子總木脂素由北華大學林學院自制提純，實驗時用蒸餾水稀釋溶解至所需濃度；D-半乳糖購自Sigma；SP試劑盒購于福州邁新試劑公司；Ub、GPR78、PDI、CHOP、Bcl-2、Bax及β-actin抗體購自Santa Cruz。

2 衰老小鼠模型的建立、分組與給藥

健康昆明小鼠，雌雄各半，體重18～20 g，吉林大學實驗動物部提供。合格證號為SCXK-(吉)2008-0003。清潔級動物室飼養，飲水不限，定時喂食。

參照文獻[7]復制衰老小鼠模型。取小鼠50只，雌雄各半，經適應性飼養1周，按體重隨機分為5組: 空白對照組、模型組、五味子總木脂素低劑量組、五味子總木脂素中劑量組和五味子總木脂素高劑量組，每組10只，正常飲食。除空白對照組外，其余各組每天1次頸、背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，連續注射10周。同時，五味子總木脂素低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按35 mg/kg、70 mg/kg、140 mg/kg蒸餾水配制藥液，灌胃給藥，每天1次，連續給藥10周[8]。斷髓處死小鼠，冰上低溫解剖取腦，部分多聚甲醛固定，部分凍存于-80 ℃。

3 方法

3.1學習記憶能力測試(小鼠跳臺實驗) 學習訓練于停止給藥后次日進行。每組各取1只，平行操作。實驗裝置為一長方形反射箱，大小為32 cm×22.5 cm× 33 cm，用黑色塑料板分隔成6間。底面鋪以銅柵，間距為0.5 cm，每間左角置一高度和直徑均為4.5 cm 的橡膠平臺。將小鼠置于跳臺儀隔間內，適應環境3 min，然后立即通以32 V 交流電。其正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激，以雙足同時接觸銅柵為錯誤反應，訓練5 min(避免電擊死亡)。每只訓練3 次。

記憶測試于學習訓練24 h 后進行。將小鼠放置于跳臺上，同時按動記時器，記錄第1 次跳下平臺時間，此為觸電潛伏期。并記錄5 min 內跳下平臺受到電擊的次數，即錯誤反應數，作為記憶指標。

學習記憶實驗結束后斷頭處死，后立即于冰臺上解剖取出全腦組織，用預冷的生理鹽水反復沖洗，濾紙吸干，用于Western blotting實驗的腦組織置于-80 ℃ 超低溫冰箱保存待用，用于切片的腦組織置于4%多聚甲醛中固定。

3.2Western blotting檢測Ub、PDI、GRP78、CHOP、Bcl-2和Bax蛋白的表達 用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，以β-actin的水平作為等量蛋白質上樣對照，取50 μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE后， 轉至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h，用含0.01% Tween 20的TBS緩沖液 (TBST) 漂洗3次，每次10 min；加入相應的抗體Ub (1∶200)和PDI (1∶200)、GPR78 (1∶200)、CHOP(1∶200)，Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶200)，4 ℃ 孵育過夜；TBST漂洗3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗 (1∶1 000)，37 ℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統)拍照，同時以β-actin為內參照，進行蛋白表達分析，蛋白表達量用光密度比值表示。

3.3免疫組化方法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達 應用SP 免疫組化染色法。抗Bcl-2多克隆抗體以1∶100稀釋，抗Bax單克隆抗體以1∶100稀釋，Ⅱ抗為羊抗兔/鼠IgG 抗體。顯微鏡(Olympus) 下觀察組織中蛋白表達，并攝片。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差 (mean±SD) 表示，多組間樣本均數比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠跳臺實驗檢測北五味子總木脂素對衰老小鼠學習記憶能力的影響

在學習測試中，模型組小鼠5 min 內錯誤次數較對照組增多(P<0.05)，SCL低(L)、中(M)、高(H)劑量組小鼠5 min 內錯誤次數較模型組減少(P<0.05)。在記憶測試中，模型組小鼠首次跳下平臺的潛伏期較空白對照組縮短(P<0.05)，5 min內錯誤次數增多(P<0.05)；與模型組比較，SCL低、中、高劑量組小鼠首次跳下平臺的潛伏期延長(P<0.05)，5 min 內錯誤次數減少(P<0.05)，見表1。

表1 北五味子總木脂素對衰老小鼠學習記憶能力的影響

2 北五味子總木脂素對衰老小鼠腦組織中Ub蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組Ub表達增加(P<0.05)；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組Ub蛋白表達降低(P<0.05)，見圖1。

3 北五味子總木脂素對衰老小鼠腦組織中GRP78蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組GRP78蛋白表達增加(P<0.05)；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組GRP78蛋白表達降低(P<0.05)，見圖2。

4 北五味子總木脂素對衰老小鼠腦組織中PDI蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組PDI蛋白表達增加(P<0.05)；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組PDI蛋白表達降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 1. The effect of SCL on Ub protein expression of the aging mouse brain tissues detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: SCL(L) group; 4: SCL(M) group; 5: SCL (H) group.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs model group.

Figure 2. Effect of SCL on GRP78 protein expression of the aging mouse brain tissue detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs model group.

5 北五味子總木脂素對衰老小鼠腦組織中CHOP蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組CHOP蛋白表達增加(P<0.05)；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組CHOP蛋白表達降低(P<0.05)，見圖4。

6 北五味子總木脂素對衰老小鼠大腦皮質Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，空白對照組神經細胞形態正常，細胞核清晰，胞漿豐富；模型組大部分神經細胞變性，神經元體積變小，胞核與胞漿界限模糊，細胞核固縮成三角形或不規則形；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組神經細胞形態規則仍有不同程度的神經細胞變性，但變性細胞數量明顯減少，見圖5、6。

Figure 3. The effect of SCL on PDI protein expression of the aging mouse brain tissue detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs model group.

空白對照組神經細胞細胞漿內可見棕黃色顆粒，Bcl-2蛋白為陽性表達；模型組神經細胞胞漿內棕黃色顆粒含量降低，Bcl-2蛋白為陰性表達；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組神經細胞細胞漿內可見棕黃色顆粒，Bcl-2蛋白為陽性表達，見圖5。

空白對照組神經細胞胞漿內無棕黃色顆粒，Bax蛋白為陰性表達；模型組神經細胞胞漿內可見棕黃色顆粒，Bax蛋白為陽性表達；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組神經細胞胞漿內無棕黃色顆粒，Bax蛋白為陰性表達，見圖6。

Figure 4. The effect of SCL on CHOP protein expression of the aging mouse brain tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs model group.

7 北五味子總木脂素對衰老小鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

與空白對照組相比，模型組線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；與模型組相比，SCL低、中、高劑量組Bcl-2蛋白增加(P<0.05)，Bax蛋白表達降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)，見圖7。

討 論

北五味子藥用其成熟、干燥的果實，其中含有木脂素、多糖、揮發油、脂肪酸和維生素等活性成分，具有增強心血管功能、抗氧自由基及免疫增強作用。本實驗室前期研究結果顯示，北五味子具有明顯的鎮靜、催眠、促睡眠作用，并對劑量呈現一定依賴性[9-10]。北五味子總木脂素具有抗疲勞、增強學習記憶能力、增強免疫系統功能等作用[11]。五味子油對2型糖尿病大鼠胰島B細胞具有保護作用[12]。北五味子總木脂素具有抑制過氧化氫(H2O2) 誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡的作用，與線粒體途徑凋亡有關[13]。本課題從北五味子延緩衰老方面進行研究。

Figure 5. The effect of SCL on Bcl-2 protein expression of the aging mouse cerebral cortex observed by immunohistochemistry (×400).

Figure 6. The effect of SCL on Bax protein expression in the aging mouse cerebral cortex observed by immunohistochemistry (×400).

D-半乳糖誘發動物衰老與氧化應激損傷和自由基毒性有關[14]。D-半乳糖可誘發體內自由基蓄積，使蛋白、脂質及核酸過氧化，引起線粒體結構損傷和功能紊亂，出現能量代謝障礙，導致細胞損傷。機體衰老以腦結構和腦功能的改變為重要特征。隨著大腦老化，灰色物質萎縮，白色物質功能開始衰退[15]。萎縮現象在前額皮質和海馬體處非常明顯，前額皮質的功能是幫助人們進行高級思考和推理，而海馬體在記憶過程中起著核心作用。學習記憶障礙是腦衰老的一種重要表現。我們的實驗結果顯示，D-半乳糖誘導小鼠表現為學習記憶能力障礙，形成衰老的行為學改變；通過免疫組化結果，觀察到衰老小鼠大腦皮質神經細胞變性，形成衰老的形態學改變。北五味子總木脂素能改善衰老小鼠的學習記憶能力，延緩衰老的發生和發展。

目前研究發現，在衰老相關的疾病中，細胞活性氧生成過多可引起線粒體能量代謝障礙，從而導致一些神經退行性疾病的發生或惡化[16]。線粒體的完整性由Bcl-2超家族的幾個成員控制。細胞內存在促凋亡和抗凋亡2個Bcl-2蛋白家族。在凋亡發生時，促凋亡蛋白Bax和Bak二聚化，從而插入線粒體外膜，啟動內源性凋亡信號通路，使得生物膜上形成孔洞。抗凋亡蛋白Bcl-2可以中斷這一相互作用，避免線粒體膜通透化，故細胞凋亡的發生取決于Bcl-2 和Bax的相對濃度，即Bcl-2 /Bax 值。免疫組化結果觀察到衰老小鼠神經細胞胞漿中抗凋亡蛋白Bcl-2呈陰性表達，促凋亡蛋白Bax呈陽性表達，SCL低、中、高劑量組神經細胞胞漿中抗凋亡蛋白Bcl-2呈陽性表達，促凋亡蛋白Bax呈陰性性表達。Western blotting結果顯示，衰老小鼠Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達增加，Bcl-2/Bax降低；SCL低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達水平增加，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax增加，這些結果提示北五味子總木脂素通過減少神經細胞凋亡而發揮抗小鼠腦組織衰老的作用。

Figure 7. The effects of SCL on the protein expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and proapoptotic protein Bax, and Bcl-2 /Bax ratio in the aging mouse brain tissue detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs model group.

衰老不僅能引起機體各組織器官功能下降、免疫功能下降易感染以外，還引起阿爾茨海默(Alzheimer)病等相關疾病[17]。在Alzheimer病患者腦中可見β淀粉性蛋白沉積，由于錯誤折疊或變性蛋白質在神經細胞內堆積而導致中樞神經系統功能障礙，細胞凋亡速率是正常對照組的50多倍。異常蛋白或聚集的錯誤折疊的蛋白是被泛素化修飾的，所以常常用Ub代表蛋白發生異常或錯誤折疊[18]。

內質網是真核細胞的重要細胞器，提供了蛋白質合成、折疊、修飾然后分泌到細胞外，或表達于細胞膜表面的主要場所[19]。內質網內新生成蛋白質的正確折疊、成熟和穩定由內質網內的幾種駐留分子伴侶來完成，其中包括了GRP78以及幾種參與蛋白折疊的酶類，例如硫氧還蛋白超家族成員PDI。在各種生理和病理的情況下，包括缺氧、氧化損傷，都有可能會導致內質網的蛋白折疊負荷和能力的失衡，從而引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網內堆積，此時即發生內質網應激。內質網應激發生時，其腔內的PDI蛋白表達增加、活化以恢復內質網蛋白折疊能力。內質網應激是進化保守機制，其整合了信號轉導途徑未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。哺乳動物細胞的UPR反應是由3個跨膜蛋白所控制，都是存在于內質網膜上的應激感受因子，它們分別是PERK、IRE1和ATF6。UPR首要的作用就是減輕內質網蛋白負擔。GRP78在內質網應激時與IRE-1α、PERK、ATF6解離，激活內質網應激信號通路[20]。

內質網應激是細胞對內外刺激的適應性反應。適度內質網應激誘導GRP78 等內質應激蛋白表達上調，有利于內質網處理未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，并促進鈣穩態恢復；持續而嚴重的內質網應激可明顯上調GRP78的表達，誘導內質網應激相關的CHOP 的表達及活化，觸發內質網應激相關凋亡途徑[21]。CHOP 又稱生長停滯及DNA損傷蛋白153是內質網應激特異的轉錄因子，過量表達的CHOP 由胞漿轉位至細胞核，進而通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2，導致Bax 從胞漿轉位至線粒體，促進細胞凋亡[22]，或者誘導促凋亡蛋白Bim表達等途徑促進細胞凋亡[23]。另外，CHOP 可通過上調內質網氧化酶1α( ER oxidase 1α，ERO1α) 誘導三磷酸肌醇受體介導的鈣釋放，激活鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶，進而觸發線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。

我們的結果顯示，衰老模型組Ub蛋白表達水平增加，內質網應激標志蛋白PDI表達增加，GRP78和內質網途徑凋亡調控蛋白CHOP蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達增加，Bcl-2/Bax降低；SCL低、中、高劑量組Ub蛋白、PDI 、GRP78和CHOP蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達水平增加，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax增加，這提示北五味子總木脂素通過減少內質網應激誘導的凋亡而發揮抗小鼠腦衰老的作用。

細胞凋亡途徑分為內源性與外源性，內源性凋亡有線粒體途徑和內質網途徑2條主要的信號途徑。Bcl-2 蛋白家族是線粒體途徑凋亡的關鍵分子，CHOP 被認為是內質網應激介導凋亡的特異性標志。內質網和線粒體之間存在結構和功能上的緊密聯系，參與調控內質網到線粒體間通信的因素還需深入研究。

[參 考 文 獻]

[1] Donmez G. Sirtuins as possible targets in neurodegenerative diseases[J]. Curr Drug Targets, 2013, 14(6):644-647.

[2] 林紅梅, 韓紅祥, 李岳樺, 等. 五味子木脂素與生態因子相關性研究[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(24):4281-4286.

[3] 譚敦勇, 李楚杰.衰老分子機制研究的某些進展[J]. 中國病理生理雜志, 2000, 16(1):79-83.

[4] 席興字. 細胞自噬與衰老[J]. 生命的化學, 2011, 31(2):268-271.

[5] Szegezdi E, Logue SE, Gorman AM, et al. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis[J]. EMBO Rep, 2006, 7(9):880-885.

[6] 鞠文博. 北五味子總木脂素抗小鼠衰老過程中自噬作用的實驗研究[D]. 吉林: 北華大學, 2013.

[7] Orgel LE. The maintenance of the accuracy of protein synthesis and its relevance to aging: a correction [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1970, 67(3):1476.

[8] Bruce R, Troen MD. The biology of aging[J]. Mt Sinai J Med，2003, 70(1):3-22.

[9] 陳建光, 王春梅, 高曉旭, 等. 一種鎮靜安神促進睡眠的口服液及其制備方法: 中國, CN103202896A[P].2013-07-17.

[10] 石 繪, 萬麗華, 李 賀，等. 北五味子木脂素對小鼠鎮靜催眠作用的實驗研究[J]. 中國老年保健醫學, 2012, 10(5):27-28.

[11] 李 賀, 陳建光, 王春梅, 等.一種具有抗衰老作用的保健食品及其制備方法: 中國, CN103141833A [P],2013-06-12.

[12] 安麗萍，王英平，王春梅，等. 五味子油對鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠的影響[J]. 吉林大學學報：醫學版, 2012, 38(1):84-88.

[13] 姜恩平, 吳金義, 陳建光. 北五味子總木脂素對H2O2誘導PC12 細胞凋亡的影響[J]. 吉林大學學報：醫學版, 2009, 35(5):466-469.

[14] 曲 嫻，方文娟，李 冰，等. 維生素E對D- 半乳糖誘致衰老小鼠腦抗氧化能力、鈣穩態和線粒體DNA(mtDNA)損傷的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008,24(3):523-526.

[15] 崔玉豐，張博妍，張 瑞，等. 白藜蘆醇對衰老模型小鼠腦組織形態學和氧化應激水平的影響[J]. 衛生研究, 2013, 42(6):996-998.

[16] 葉 薇, 陳賽慧, 郝東杰. 衰老過程中線粒體順烏頭酸酶活性變化對能量合成的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(7):1275-1282.

[17] 賀改英，徐 穎，吳麗莉，等. 銀杏酮酯對衰老大鼠海馬炎癥相關細胞因子的調節作用[J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(14):2130-2134.

[18] Bhutia SK, Dash R, Das SK, et al. Mechanism of autophagy to apoptosis switch triggered in prostate cancer cells by antitumor cytokine melanoma differentiation-associated gene 7/interleukin-24 [J]. Cancer Res, 2010, 70(9):3667-3676.

[19] G?rlach A, Klappa P, Kietzmann T. The endoplasmic reticulum: folding, calcium homeostasis, signaling, and redox control[J]. Antioxid Redox Signal， 2006, 8(9-10):1391-1418.

[20] Lee AS. GRP78 induction in cancer: therapeutic and prognostic implications[J]. Cancer Res, 2007, 67(8):3496-3499.

[21] 陶天琪，王曉礽，徐菲菲，等. MR-1 通過抑制PERK/Nrf2 途徑減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):193-202.

[22] 姚樹桐，秦樹存. 內質網應激在動脈粥樣硬化發生、發展和防治中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30( 2):364-368.

[23] 夏 珍，李菊香，丁 浩，等. 內質網應激在Bim 介導缺氧致心肌細胞凋亡中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(12):2121-2127.