IL-17在幽門(mén)螺桿菌不同亞型菌株感染AGS細(xì)胞中的表達(dá)

馬振華 鄒春燕

幽門(mén)螺桿菌(HP)感染在慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等各種胃腸道疾病中是一個(gè)至關(guān)重要的致病因素[1]。目前,我國(guó)是HP感染率及胃癌的發(fā)病率最高的國(guó)家[2]。根據(jù)cag致病島的有無(wú),將HP分為I型和II型,I型包含cag致病島[3]。I型比II型更易誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)的改變及更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[4]。本研究利用I型和II型HP感染AGS細(xì)胞24 h,48 h,通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-17的濃度,進(jìn)而討論HP不同分型對(duì)IL-17的誘導(dǎo)作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 AGS細(xì)胞的培養(yǎng) 將AGS細(xì)胞(購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)接種至培養(yǎng)皿,加入RPMI1640培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。

1.2 HP的培養(yǎng) 在微需氧環(huán)境下,HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株(美國(guó)ATCC公司)用哥倫比亞血瓊脂選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 HP不同菌株感染AGS細(xì)胞 HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),分別取少許菌液涂片,用PBS溶液將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株分別清洗2遍,5000轉(zhuǎn),離心5 min；分別制備HP懸液。

AGS細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底的80%時(shí),棄掉原培養(yǎng)基,按細(xì)菌：細(xì)胞=100：1比例加入HP懸液,放入37℃、5%CO2孵育箱共同培養(yǎng)24 h、48 h。

1.4 ELISA

1.4.1 ELISA檢測(cè)IL-17濃度 IL-17酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)自南京奧尼多福公司,取出上述不同菌株感染的AGS細(xì)胞,3000轉(zhuǎn),離心20 min。收集細(xì)胞上清,ELISA檢測(cè)IL-17濃度。具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 待測(cè)樣品濃度的計(jì)算 以O(shè)D值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出曲線方程,然后根據(jù)待測(cè)樣品的OD值在該曲線上求出相應(yīng)的IL-17濃度,再乘以稀釋倍數(shù)5倍,即待測(cè)樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Bartlett檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊,兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。若方差不齊,則采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HP不同亞型菌株感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后誘導(dǎo)IL-17的表達(dá)與空白對(duì)照組比較 HP I型與II型分別感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后較空白對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 HP不同亞型感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后IL-17 濃度的比較(±s)

表1 HP不同亞型感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后IL-17 濃度的比較(±s)

注：與空白對(duì)照組相比,aP＜0.05

不同菌株 24 h 48 h空白對(duì)照組 10.01±3.4 10.00±3.2 HP26695感染組 102.17±2.20a 105.87±7.00a HPK5感染組 124.68±3.32a 126.49±13.45a

2.2 HP不同亞型菌株誘導(dǎo)IL-17的表達(dá) 24 h時(shí)HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細(xì)胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；48h時(shí)HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細(xì)胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；結(jié)果提示HP I型HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細(xì)胞產(chǎn)生IL-17濃度大。見(jiàn)表2。

表2 HP感染AGS細(xì)胞各時(shí)間段IL-17 濃度的比較(±s)

表2 HP感染AGS細(xì)胞各時(shí)間段IL-17 濃度的比較(±s)

注：與 HP26695 相比 ,aP＜0.05

不同菌株 24 h 48 h HP26695感染組 102.17±2.20 105.87±7.00 HPK5感染組 124.68±3.32a 126.49±13.45a

2.3 HP同一亞型菌株感AGS細(xì)胞24 h、48 h后IL-17的表達(dá) I型HP感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后,IL-17濃度表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); II型HP感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后,IL-17濃度表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 HP感染AGS細(xì)胞各時(shí)間段IL-17 濃度的比較(±s)

表3 HP感染AGS細(xì)胞各時(shí)間段IL-17 濃度的比較(±s)

注：與 24 h 相比 ,aP＞0.05

不同菌株 HP26695感染組 HPK5感染組24 h 102.17±2.20 124.68±3.32 48 h 105.87±7.00a 126.49±13.45a

3 討論

IL-17是重要的促炎性細(xì)胞因子,其可誘導(dǎo)多種細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì),IL-17不僅與炎性反應(yīng)密切相關(guān),亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關(guān)［5］。研究表明,IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用,并可作用于腫瘤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等［6］。同時(shí),亦發(fā)現(xiàn)腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導(dǎo)IL-17細(xì)胞因子。IL-17可通過(guò)CXCL8因子促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集,此外,中性粒細(xì)胞亦可通過(guò)CCL2和CCL20因子促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生。IL-17可以通過(guò)上調(diào)腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞IL-6的表達(dá)量,IL-6作用于STAT3途徑,從而激活促癌基因的產(chǎn)生,發(fā)揮延長(zhǎng)細(xì)胞周期、抗凋亡、促進(jìn)腫瘤血管生成［7］。

本研究結(jié)果顯示HP不同亞型感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后IL-17濃度表達(dá)量均較空白對(duì)照組表達(dá)量明顯升高,這與蘇濤［8］等研究一致,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HP可誘導(dǎo)IL-17濃度表達(dá),從而加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果亦顯示,I型HP感染AGS細(xì)胞后產(chǎn)生IL-17濃度大。此外,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IL-17隨腫瘤進(jìn)展而增加,且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關(guān)［9］,但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示I型和II型HP均感染AGS細(xì)胞24 h、48 h后IL-17濃度表達(dá)無(wú)明顯差異,這與上述觀點(diǎn)相悖,有待進(jìn)一步研究探討,明確是否隨著時(shí)間的推移,IL-17濃度變化呈升高趨勢(shì)。

綜上所述,在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,HP不同亞型菌株感染后所誘導(dǎo)IL-17的表達(dá)各不相同,尤其I型HP是誘導(dǎo)IL-17濃度表達(dá)的重要因素,充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導(dǎo)IL-17濃度表達(dá)的作用機(jī)制,使IL-17可作為潛在治療靶點(diǎn),以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

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