IL—17在幽門螺桿菌不同亞型菌株感染AGS細胞中的表達

馬振華　鄒春燕

【摘要】 目的 探討人白介素-17（IL-17）在幽門螺桿菌（HP）不同亞型菌株感染AGS細胞中的表達情況， 并探討可能的作用機制。方法 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）法檢測IL-17的表達， 并分析其與HP不同亞型間的關系。結果 HP I型與II型分別感染AGS細胞24 h、48 h后較空白對照組差異具有統計學意義（P<0.05）， HP I型與II型感染AGS細胞24 h后比較差異具有統計學意義（P<0.05）， HP I型與II型感染AGS細胞48 h后比較差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 HP不同亞型均可誘導IL-17的表達， 且HP I型更易誘導IL-17的表達。

【關鍵詞】 幽門螺桿菌I型；幽門螺桿菌II型；AGS細胞；人白介素-17；酶聯免疫吸附法

【Abstract】 Objective To investigate the expression of interleukin-17（IL-17） in AGS cells which infected by strains of helicobacter pylori（HP） in different subtypes and explore the possible mechanism. Methods By enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA） to detect the expression of IL-17， and to analyze its relationship with HP in different subtypes. Results HP type I and Type II infected AGS cells 24 h， 48 h and control group were significantly different（P<0.05）. There were obvious differences in 24 h after HP type I and type II infection in AGS cells， there were significant differences in comparison with 48 h after HP type I and type II infection in AGS cells（P<0.05）. Conclusion HP in different subtypes can induce the expression of IL-17， and type I can more easily induce the expression of IL-17.

【Key words】 Helicobacter pylori type I； Helicobacter pylori type II； AGS cells； Interleukin-17； Enzyme-linked immuno sorbent assay

幽門螺桿菌（HP）感染在慢性活動性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等各種胃腸道疾病中是一個至關重要的致病因素[1]。目前， 我國是HP感染率及胃癌的發病率最高的國家[2]。根據cag致病島的有無， 將HP分為I型和II型， I型包含cag致病島[3]。I型比II型更易誘導細胞形態的改變及更嚴重的炎癥反應[4]。本研究利用I型和II型HP感染AGS細胞24 h， 48 h， 通過ELISA檢測IL-17的濃度， 進而討論HP不同分型對IL-17的誘導作用及機制。

1 資料與方法

1. 1 AGS細胞的培養 將AGS細胞（購買于中國科學院上海細胞研究所）接種至培養皿， 加入RPMI1640培養基， 放入37℃、5%CO2孵育箱培養。

1. 2 HP的培養 在微需氧環境下， HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株（美國ATCC公司）用哥倫比亞血瓊脂選擇培養基培養。

1. 3 HP不同菌株感染AGS細胞 HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株處于對數生長期時， 分別取少許菌液涂片， 用PBS溶液將處于對數生長期的HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株分別清洗2遍， 5000轉， 離心5 min；分別制備HP懸液。

AGS細胞覆蓋培養瓶底的80%時， 棄掉原培養基， 按細菌：細胞=100：1比例加入HP懸液， 放入37℃、5%CO2孵育箱共同培養24 h、48 h。

1. 4 ELISA

1. 4. 1 ELISA檢測IL-17濃度 IL-17酶聯免疫檢測試劑盒購買自南京奧尼多福公司， 取出上述不同菌株感染的AGS細胞， 3000轉， 離心20 min。收集細胞上清， ELISA檢測IL-17濃度。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1. 4. 2 待測樣品濃度的計算 以OD值為縱坐標， 濃度為橫坐標， 做出標準曲線并求出曲線方程， 然后根據待測樣品的OD值在該曲線上求出相應的IL-17濃度， 再乘以稀釋倍數5倍， 即待測樣品的濃度。

1. 5 統計學方法 實驗數據用SPSS19.0統計軟件分析， 計量資料用均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗， 計數資料用率（%）表示， 采用χ2檢驗， P<0.05表示差異有統計學意義。采用Bartlett檢驗對各組數據進行方差齊性檢驗。若方差齊， 兩個樣本均數比較采用兩樣本t檢驗。若方差不齊， 則采用秩和檢驗。

2 結果

2. 1 HP不同亞型菌株感染AGS細胞24 h、48 h后誘導IL-17的表達與空白對照組比較 HP I型與II型分別感染AGS細胞24 h、48 h后較空白對照組差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 HP不同亞型菌株誘導IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；結果提示HP I型HPK5菌株誘導AGS細胞產生IL-17濃度大。見表2。

2. 3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統計學意義（P>0.05）； II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子， 其可誘導多種細胞釋放炎癥介質， IL-17不僅與炎性反應密切相關， 亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關[5]。研究表明， IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發生發展的作用， 并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等[6]。同時， 亦發現腫瘤所處的微環境可直接誘導IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集， 此外， 中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產生。IL-17可以通過上調腫瘤細胞及基質細胞IL-6的表達量， IL-6作用于STAT3途徑， 從而激活促癌基因的產生， 發揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成[7]。

本研究結果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高， 這與蘇濤[8]等研究一致， 實驗結果提示HP可誘導IL-17濃度表達， 從而加重炎癥反應。本研究結果亦顯示， I型HP感染AGS細胞后產生IL-17濃度大。此外， 大多數學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加， 且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關[9]， 但本實驗結果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異， 這與上述觀點相悖， 有待進一步研究探討， 明確是否隨著時間的推移， IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述， 在胃癌發生發展過程中， HP不同亞型菌株感染后所誘導IL-17的表達各不相同， 尤其I型HP是誘導IL-17濃度表達的重要因素， 充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導IL-17濃度表達的作用機制， 使IL-17可作為潛在治療靶點， 以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

參考文獻

[1] Kusters JG， van Vliet AH， Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinic Microbiology Rev， 2006， 19（4）：449-490.

[2] Zhu YL， Zheng S， Du Q， et al. Characterization of Cag A variable region of Helicobacter pylori isolates from Chinese patients. World J Gastroenterol， 2005， 11（8）：880-884.

[3] Covacci A， Rappuoli R. Helieobacter pylori：after the genomes， back to biology. J Exp Med， 2003， 197（1）：807.

[4] Correa P， Piazuelo MB.Evolutionary History of the Helicobacter pylori “Genome：Implications for Gastric carcinogenesis”. Cut Liver， 2012， 6（1）：21-28.

[5] Su X， Ye J， Hsueh EC， et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells. J Immunol ， 2010（184）：1630-1641.

[6] Kuang DM， Peng C， Zhao Q， et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells. Hepatology， 2010， 51（1）：154-164.

[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 蘇濤. IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義. 第四軍醫大學， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]

2. 2 HP不同亞型菌株誘導IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；結果提示HP I型HPK5菌株誘導AGS細胞產生IL-17濃度大。見表2。

2. 3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統計學意義（P>0.05）； II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子， 其可誘導多種細胞釋放炎癥介質， IL-17不僅與炎性反應密切相關， 亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關[5]。研究表明， IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發生發展的作用， 并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等[6]。同時， 亦發現腫瘤所處的微環境可直接誘導IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集， 此外， 中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產生。IL-17可以通過上調腫瘤細胞及基質細胞IL-6的表達量， IL-6作用于STAT3途徑， 從而激活促癌基因的產生， 發揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成[7]。

本研究結果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高， 這與蘇濤[8]等研究一致， 實驗結果提示HP可誘導IL-17濃度表達， 從而加重炎癥反應。本研究結果亦顯示， I型HP感染AGS細胞后產生IL-17濃度大。此外， 大多數學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加， 且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關[9]， 但本實驗結果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異， 這與上述觀點相悖， 有待進一步研究探討， 明確是否隨著時間的推移， IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述， 在胃癌發生發展過程中， HP不同亞型菌株感染后所誘導IL-17的表達各不相同， 尤其I型HP是誘導IL-17濃度表達的重要因素， 充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導IL-17濃度表達的作用機制， 使IL-17可作為潛在治療靶點， 以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

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[8] 蘇濤. IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義. 第四軍醫大學， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]

2. 2 HP不同亞型菌株誘導IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較， 差異有統計學意義（P<0.05）；結果提示HP I型HPK5菌株誘導AGS細胞產生IL-17濃度大。見表2。

2. 3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統計學意義（P>0.05）； II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子， 其可誘導多種細胞釋放炎癥介質， IL-17不僅與炎性反應密切相關， 亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關[5]。研究表明， IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發生發展的作用， 并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等[6]。同時， 亦發現腫瘤所處的微環境可直接誘導IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集， 此外， 中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產生。IL-17可以通過上調腫瘤細胞及基質細胞IL-6的表達量， IL-6作用于STAT3途徑， 從而激活促癌基因的產生， 發揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成[7]。

本研究結果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高， 這與蘇濤[8]等研究一致， 實驗結果提示HP可誘導IL-17濃度表達， 從而加重炎癥反應。本研究結果亦顯示， I型HP感染AGS細胞后產生IL-17濃度大。此外， 大多數學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加， 且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關[9]， 但本實驗結果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異， 這與上述觀點相悖， 有待進一步研究探討， 明確是否隨著時間的推移， IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述， 在胃癌發生發展過程中， HP不同亞型菌株感染后所誘導IL-17的表達各不相同， 尤其I型HP是誘導IL-17濃度表達的重要因素， 充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導IL-17濃度表達的作用機制， 使IL-17可作為潛在治療靶點， 以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

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[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 蘇濤. IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義. 第四軍醫大學， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]