人臍帶間充質干細胞移植治療血管性癡呆的可能性

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人臍帶間充質干細胞移植治療血管性癡呆的可能性

何燕王俊魏云鴻金醒昉

(昆明醫科大學附屬延安醫院，云南昆明650051)

關鍵詞〔〕間充質干細胞;細胞移植;血管性癡呆

第一作者：何燕(1980-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事心腦血管病研究。

我國老年性癡呆中血管性癡呆(VD)占第二位，在腦卒中患者中VD的患病率為12%～36.3%〔1〕。間充質干細胞(MSCs)存在于全身結締組織和器官間質中。人臍帶MSCs(HUC-MSCs)成功克服了骨髓MSCs含量低、受年齡影響大等諸多限制，而且具有來源廣泛、免疫原性低等優點。HUC-MSCs在組織工程、神經系統、肝臟疾病、心血管系統、免疫疾病、腫瘤疾病等方面取得了巨大的進展。已有多項研究表明，體外培養的HUC-MSCs可向神經細胞方向分化〔2，3〕，且HUC-MSCs移植治療腦卒中的動物實驗研究也取得了可喜的成果〔4〕。因此，HUC-MSCs有可能用于VD的治療。

1VD的發病機制

VD是由腦血管因素導致腦組織損害引起的癡呆綜合征，其確切發病機制尚不明確。目前較為明確的機制有如下幾個方面：①膽堿能傳導通路受損：VD的記憶功能障礙與中樞膽堿能系統有著必然的聯系，大鼠缺血再灌注后乙酰膽堿(Ach)濃度下降，同時給予擬膽堿能藥物能改善學習記憶功能。許多研究證明，記憶突觸即為膽堿能突觸，膽堿能神經通路本身即參與構成記憶痕跡隔閡-海馬的傳導通路與空間識別、工作記憶有關，大細胞基底核-大腦皮質的傳導通路與學習過程的調制、參照記憶有關。VD大鼠腦組織Ach合成酶(ACHE)活性明顯升高〔5〕。膽堿乙酰轉移酶(CHAT)免疫組化表明，海馬CA1區CHAT免疫反應陽性神經元和纖維數量明顯減少，與大鼠的學習記憶障礙程度呈正相關。這些部位的損傷可導致皮質、海馬及大細胞基底核細胞萎縮，膽堿能傳導通路受損，從而引起膽堿能缺陷和學習記憶功能障礙〔6，7〕。②神經細胞凋亡：現有研究表明，在腦組織缺血早期，由于腦缺血過度激活谷氨酸受體，導致細胞內的Ca2+超載、自由基數目增加、細胞內的線粒體損傷受損，出現神經元和膠質細胞的凋亡〔8〕。尤其是海馬CA1區神經元和纖維數量明顯減少可嚴重影響記憶功能。③氧自由基：腦缺血再灌注的急性期可產生大量的自由基，自由基的連鎖反應主要攻擊灰質的神經元等富含脂質的腦細胞，引起磷脂破壞降解從而發生變性失能，使細胞膜的通透性大大增加，從而發生了細胞的毒性水腫，興奮性遞質釋放。自由基由于連鎖反應而發生的急速蓄積，進一步攻擊其他細胞的生物膜結構，造成神經細胞的壞死，半暗帶區進一步惡化，梗死范圍迅速擴展。④炎性機制：急性腦缺血后，在繼發性神經損傷中起主要作用的是炎性反應，其中白細胞介素(IL)-1β和炎性細胞因子可引起缺血再灌注中炎性反應，其局部表達最為突出。腦缺血和再灌注時，內皮細胞、神經元等在局部被激活，通過釋放兩種關鍵的炎性因子腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α和IL-1β觸發炎癥反應，引起其他細胞因子與炎性代謝產物一起促使白細胞遷移至組織損傷區，導致血管再閉塞，引發“無再流”現象白細胞還可以產生蛋白水解酶和其他效應分子，引起神經元的直接損傷，提示炎性機制可能在VD的發病機制中起重要作用。

由此可見，VD既有腦血管病的病理學改變和膽堿能神經元的壞死，又有神經生化機制的受損，而目前認為，干細胞一方面可以在受損的組織中生成新的功能細胞，另一方面，還可以分泌多種神經營養因子(NT)、免疫調節因子及營養分子以對損傷組織進行修復。

2UC-MSCs治療VD的優勢

Romanov等〔9〕從臍靜脈內皮下層成功分離出MSCs。研究表明，臍帶中富含造血、間充質及內皮等多種干/祖細胞，其中MSCs可來源于臍帶華爾通膠，臍血管周圍，臍靜脈血管內皮下和臍血(新鮮臍血單核細胞中可分離20%～50%的MSCs)〔10〕。HUC-MSCs的優勢在于：①臍帶是胎兒的附屬物，取材方便，來源廣泛，易于收集、冷凍、保存；②從臍帶華爾通膠中提取的MSC取材方便，相對純凈，致瘤性和病毒、細菌污染可能性均較骨髓干細胞低；③不表達或低表達免疫排斥相關標記，免疫原性低，是一類免疫缺陷細胞，異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，在臨床應用上還避免了胚胎干細胞的倫理爭議；④UC-MSCs含量豐富，原代培養即可獲取大量細胞，其分化潛能介于胚胎干細胞和成體干細胞之間，既不會發生自發分化又不會無限增殖而形成畸胎瘤，又易于分化為 3個胚層衍生的多種成熟細胞；⑤與骨髓MSCs相比，不會隨著傳代次數增加和機體年齡增長導致增殖能力和分化能力降低〔11〕。因此，HUC-MSCs已被當做是臨床和科研工作中MSCs的一個更佳來源。

3UC-MSCs向神經干細胞的轉化

UC-MSCs具有較強的可塑性，能發育成多種不同的細胞，成為人MSCs的重要來源。實驗〔2〕證明，HUC-MSCs可以誘導為神經細胞和神經膠質細胞。Mitchell等〔12〕先以堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)預處理過夜，再以多種化學誘導劑進行誘導，結果發現大部分細胞轉變成神經元樣細胞，并高水平地表達神經元標志物β-Ⅲ型微管蛋白和神經微絲。Fu等〔2〕以神經元條件培養基進行誘導，第3天時可見細胞發生形態學改變并開始表達神經元抗核抗體和神經微絲；第6天時開始表達紅藻氨酸鹽受體和谷氨酸脫羧酶；第9～12天時神經微絲的表達水平進一步上升并可檢測到谷氨酸誘發的內向電流，表明這時的細胞已轉化為成熟神經元。Ding等〔3〕發現以bFGF、β-巰基乙醇、NT-3、神經生長因子和腦源性NT(BDNF)對克隆擴增的UC-MSCs進行誘導后約60%的細胞可表達微管相關蛋白-2，32%表達膠質纖維酸性蛋白。Koh等〔13〕對將UC-MSCs進行體外誘導后發現，約有(77.4±17.8)%的細胞表達神經元特異性標志物如β-Ⅲ型微管蛋白、酪氨酸激酶受體、神經元核抗原和神經微絲-M，而表達星形細胞標志物膠質纖維酸性蛋白和少突膠質細胞標志物半乳糖腦苷脂的細胞數目則不足10%。Karahuseyinoglu等〔14〕則認為人臍帶基質細胞中的扁平、粗大的1型細胞對神經誘導分化方案基本無反應，而成纖維細胞樣的2型細胞可被誘導分化為神經元。此外，研究表明，HUC-MSCs不僅可分化為神經元和膠質細胞，還可分化為特定類型的神經元細胞。Fu等〔15〕以神經元條件培養基和成纖維細胞生長因子(FGF)-8成功地將HUC-MSCs誘導為表達酪氨酸羥化酶并分泌多巴胺的多巴胺能神經元。此外，Weiss等〔16〕還成功地將其誘導為表達酪氨酸羥化酶的膽堿能神經元。

4UC-MSCs治療VD的可能性

腦血管病、頸部血管病變、血流動力學改變等多種病因引起大腦長期低灌注，導致大腦神經細胞物質和能量代謝紊亂，促使腦部神經元發生不同程度的損傷或丟失或者由于出血導致的腦實質損傷而引起認知功能損害是VD發生的核心機制。但HUC-MSCs治療神經系統疾病尚處于起步階段，動物實驗證明移植HUC-MSCs有助于促進創傷性腦損傷后的早期功能恢復〔17〕，可改善帕金森病、脊髓損傷、腦卒中后遺癥〔18〕。目前國內外尚未見到其治療VD的臨床研究。HUC-MSCs在VD患者腦內能否存活并分化為膽堿能神經元或增加膽堿能神經元的含量及改善局部缺血腦組織的血供，成為眾多學者關注的問題。通過以上研究已經證明，HUC-MSCs內含有可向神經細胞方向分化的干細胞，并且其用于缺血性腦血管病動脈模型的治療也被證明有效。因此，HUC-MSCs可能成為治療VD的新方法，其治療VD的可能機制包括以下幾個方面：

4.1細胞替代作用UC-MSCs具有多向分化潛能，可向神經細胞系多種細胞轉化，具有神經干細胞或神經前體細胞特性。在合適的誘導條件下，神經干細胞或神經前體細胞可分化為膽堿能細胞〔16〕。如果將UC-MSCs移植到VD患者腦內，部分細胞有可能向膽堿能細胞分化，從而發揮細胞替代治療作用，改善VD患者的癥狀。

4.2神經營養支持和抑制凋亡作用神經損傷后，在神經元與靶細胞建立正確的聯系過程中，保持神經元的存活及軸突的延伸，必須獲得營養的支持才能得以實現。而NT在神經生長中起著重要的營養支持作用。實驗研究證實HUC-MSCs具有豐富的分泌功能，可分泌多種促血管因子和神經營養因子。Lin等〔19〕發現，移植于腦缺血模型的MSCs能產生bFGF等NT，促進動物的神經功能恢復和減輕缺血再灌注損傷。何遠東等〔20〕通過流式細胞儀檢測HUC-MSCs的神經營養因子譜，發現與神經營養相關的因子BDNF、表皮生長因子(EGF)、膠源NT(GDNF)、NT-3、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-1、NT-4在HUC-MSCs中均有表達，進一步驗證了HUC-MSCs通過分泌NT治療神經損傷的作用。此外，HUC-MSCs還有抑制神經細胞凋亡的作用，袁源等〔17〕實驗發現，將HUC-MSCs移植后1～3 w，動物神經功能評分較對照組明顯改善；4 w后，各組動物神經功能評分均恢復正常。免疫組織化學檢測表明少部分移植細胞表達神經元特異性烯醇化酶，膠質纖維酸性蛋白。與對照組相比，移植組損傷區VEGF表達明顯增加，凋亡細胞減少，促進神經功能恢復。

4.3 促進血管生成，改善局部血流的供應HUC-MSCs移植到腦缺血大鼠損傷局部，發現干細胞廣泛參與到血管壁中，參與血管的形成，免疫學染色還發現，部分MSCs表達血管內皮細胞特異性蛋白血管性血友病因子(vWF)〔4〕。MSCs的成血管能力在其他的缺血模型如心梗、下肢缺血中也得到了證實〔21，22〕。此外，MSCs本身可以通過旁分泌作用促進血管的增生，MSCs不僅能分泌VEGF、bFGF、肝細胞生長因子(HGF)等促血管新生的活性因子，還可以分泌血管新生所需要的細胞外基質成分如整合素、鈣黏素等，從而參與血管的生成〔23〕。Liao等〔4〕研究還證明了，HUC-MSCs有助于促進腦缺血大鼠損傷神經早期功能恢復，這種治療效果是通過刺激宿主細胞分泌VEGF，增加損傷區微血管密度來實現的。

4.4抑制炎癥反應和免疫調節作用研究發現，HUC-MSCs的移植可以減輕損傷后組織的炎癥反應，包括抑制白細胞的浸潤和小膠質細胞的激活，下調活性氧簇和炎癥因子的分泌從而減輕神經損傷。MSCs在免疫方面具有非常特殊的作用，除了本身低免疫源性外，MSCs還能調節免疫系統，發揮免疫抑制和抗炎的作用〔24，25〕。MSCs可以抑制樹突細胞遷移與成熟，使樹突細胞保持在不成熟狀態或成熟異常；MSC和淋巴細胞混合培養后，可以下調干擾素(IFN)-γ、IL-2、TNF-α等促炎因子，從而抑制T淋巴細胞的增殖，MSC還可以抑制原始T細胞和記憶T細胞，抑制淋巴細胞生長因子IL-2及其受體的表達、抑制T細胞表面共刺激因子CD80、CD86的表達而使T細胞無能〔26〕。

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〔2015-01-15修回〕

(編輯杜娟)

通訊作者：金醒昉(1962-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事老年病研究。

基金項目：云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項基金資助(No.2011FB233)

中圖分類號〔〕R741.05〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6945-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.138