電壓依賴性陰離子通道的研究進展

戴瓊艷(綜述)，段滿林(審校)

(南京軍區南京總醫院麻醉科，南京210002)

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電壓依賴性陰離子通道的研究進展

戴瓊艷△(綜述)，段滿林※(審校)

(南京軍區南京總醫院麻醉科，南京210002)

摘要：電壓依賴性陰離子通道(VDAC)位于線粒體外膜，形成了線粒體和代謝產物之間的分界，作為“守門員”控制著代謝產物的進出以及線粒體與其他細胞器的對話，同時，VDAC也是線粒體介導凋亡的關鍵成員。除了調節線粒體的代謝和產能功能，VDAC通過與不同配體和蛋白相互作用，作為細胞生存和死亡信號的匯聚點，這些功能可能使VDAC成為合理的新治療發展的靶點。現就哺乳動物VDAC蛋白(尤其是VDAC1)的結構、功能、與相關蛋白的關系以及VDAC參與的疾病作一綜述。

關鍵詞：電壓依賴性陰離子通道；線粒體；凋亡

隨著對線粒體功能研究的深入，發現其除了生物供能以外，在細胞信號轉導、胞內細胞器之間的聯系、老化，細胞增殖、疾病和凋亡調節中也有重要作用。Schein等于1976年首次在人工構建的線粒體脂質雙分子膜中發現并純化了具有電壓依賴性和陰離子選擇性的嵌入蛋白，并將其命名為電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)，它是相對分子質量為31 000的孔道蛋白，存在于所有真核生物線粒體外膜上[1]。研究表明，VDAC不僅參與能量代謝，還是細胞凋亡的關鍵成員[2],特別是在線粒體通透性轉換孔中的作用[3]，雖然線粒體通透性轉換孔復合體至今仍未成功分離，但有證據表明VDAC很可能是其組分之一。VDAC通過與Ca2+、ATP、谷氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸以及不同蛋白質相互作用，調節線粒體外膜的通透性，在維持線粒體內穩態及細胞生存方面發揮重要功能。現就VDAC的研究進展進行綜述。

1VDAC的生物學特征

1.1VDAC亞型VDAC有3種亞型，被3種不同的基因編碼：VDAC1、VDAC2和VDAC3，這3種蛋白共享著高度類似的序列，有65%～70%的同一性。所有VDAC亞型在大部分組織中均能找到，只是數量不同，其中VDAC1是最豐富的亞型，實時定量聚合酶鏈反應實驗顯示在HeLa 細胞中，mRNA水平上VDAC1是VDAC2的10倍，比VDAC3多100倍[4]。

3種亞型各有不同的生理功能。如敲除小鼠的VDAC1導致心肌和骨骼肌中呼吸鏈復合物活性產生缺陷，而敲除VDAC3，這種缺陷只出現于心臟[5]；VDAC1和VDAC2基因敲除的小鼠，呼吸容量減少[6]；而敲除VDAC3可導致雄性不育，VDAC1和VDAC3均敲除會引起生長抑制[7]。

蛋白組學調查和其他研究表明，所有VDAC亞型均是翻譯后修飾。VDAC1的氨基酸序列分析顯示第1個蛋氨酸被刪除了，而第2個氨基酸即丙氨酸被乙酰化[8]。其他報道的翻譯后修飾為VDAC的絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸殘基發生了磷酸化，賴氨酸乙酰化[9]，但這些修飾對VDAC蛋白活性的影響仍不清楚。

1.2VDAC結構1985年，Mihara和Sato[10]首次確定了VDAC的一級結構。通過VDAC結構中的親水性和疏水性殘基以及細菌膜孔蛋白的晶體學研究，推測VDAC會形成一個β桶狀結構。2008年三個研究小組[11-13]分別用不同的方法確定了VDAC1的三維結構，是由19個β折疊鏈形成的一個β桶狀結構，每條β折疊鏈平均由10個氨基酸殘基組成，其N末端結構域有25個氨基酸長度的殘基，以α螺旋形式分布于VDAC孔內，該α螺旋片段對VDAC的門控作用很關鍵，可能是作為電壓感受器，也可能調節通道對離子和代謝產物的傳導。此外，VDAC1-N末端參與凋亡的誘導，它可作為結合位點與己糖激酶(hexokinase,HK)Ⅰ和Bcl-2家族蛋白相互作用。

1.3VDAC通道活性在低電壓(10 mV)時，VDAC通道穩定的處于開放狀態(持續2 h)，表現為陰離子選擇性和對多價陰離子代謝產物通透，包括磷酸肌酸、磷酸鹽、琥珀酸鹽和ATP[14]；在高電壓(>40 mV)時，VDAC由開放轉為關閉，表現為對陽離子通透的低傳導狀態[15]。

另外，不同的物質，如Ca2+、ATP、谷氨酸鹽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等被認為與VDAC相互作用，調節VDAC的通道活性[16]。

1.4VDAC過表達與細胞生存VDAC1參與多種刺激誘導的凋亡。用小分子干擾RNA技術沉默VDAC1 表達可有效阻止順氯氨鉑誘導的凋亡和促凋亡蛋白Bax的激活，也可減少內皮抑素誘導的凋亡[17]和抑制亞硒酸鹽誘導的線粒體通透性轉換[18]。

VDAC1過表達可使線粒體內膜去極化并觸發線粒體通透性轉換，導致細胞凋亡；U-937細胞過表達鼠(m)VDAC或兔(r)VDAC導致細胞死亡70%～85%[19]。Godbole等[20]也報道，過表達水稻VDAC誘導了凋亡(約70%)；而將牙鲆VDAC轉染到魚細胞中也得到了相似的結果。

此外，化療或放療后，腫瘤生長得到有效抑制，而腫瘤細胞上的VDAC表達也增加。如凋亡敏感細胞經紫外線或者暴露于抗癌藥熊果酚苷或順氯氨鉑后，VDAC表達上調。

2VDAC與線粒體依賴性凋亡相關因子的相互作用

VDAC位于線粒體外膜，是線粒體與外界發生關系的第一道門，線粒體依賴性凋亡相關因子首先和它接觸，進而啟動后續的凋亡程序，因此它是凋亡調節的關鍵蛋白。

2.1HK離體和在體的研究表明，HK-Ⅰ和HK-Ⅱ可保護細胞避免發生線粒體介導的凋亡。HK通過與VDAC結合，抑制線粒體通透性轉換孔開放，阻止凋亡的啟動。

此外，無論在離體線粒體還是在重組的雙分子層中，當VDAC1殘基突變時，HK-Ⅰ和VDAC1的結合均被抑制，同時HK-Ⅰ的抗凋亡活性也減弱，表明HK-Ⅰ通過和VDAC1相互作用進行凋亡的調節。

2.2VDAC與Bcl-2家族蛋白Bcl-2家族是凋亡調節的關鍵蛋白，控制線粒體外膜對細胞色素C和其他凋亡因子的通透性，主要包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl等,而促凋亡蛋白包括Bax、Bak或促凋亡的BH-3 only蛋白(如Bim、Puma、Bid)，可刺激凋亡因子釋放。研究表明，Bcl-2家族蛋白對凋亡的調節是通過與VDAC相互作用進行的。VDAC1敲除的細胞中，順氯氨鉑誘導的Bax激活被抑制，卻不影響Bak激活，說明凋亡通路中，VDAC1在Bak的下游，Bax的上游。而 Bax-VDAC相互作用參與了姜黃素誘導的Bax線粒體轉位，這可被VDAC抑制劑4，4′-二異硫氰基芪-2，2′-基二磺酸阻斷，而抗VDAC抗體可抑制Bax和Bim誘導的細胞色素C釋放。同時也有學者報道，與VDAC1 N末端結構域一致的VDAC1基肽，以濃度和時間依賴的方法，與Bcl-2相互作用，抑制了它的抗凋亡活性[2]。

2.3VDAC與細胞內Ca2+信號Ca2+是線粒體通透性改變的基礎，Ca2+超載導致線粒體外膜腫脹破裂，接著細胞色素C和其他的促凋亡蛋白釋放。而VDAC對Ca2+高度通透，調節Ca2+進入內膜間隙參與線粒體通透性改變，Keinan等[21]研究發現，在VDAC上存在Ca2+結合位點，當VDAC開放時，Ca2+經VDAC流入線粒體，導致線粒體腫脹、線粒體通透性轉換孔開放，凋亡發生，而釕紅、鑭離子(La3+)也可結合該位點，抑制Ca2+內流產生凋亡抑制效應。Huang等[22]認為，VDAC和Bcl-xL相互作用促進線粒體Ca2+的吸收。因此，VDAC作為Ca2+進出線粒體的通道，在鈣穩態維持和細胞活性調節中起關鍵作用。

2.4VDAC和活性氧類介導的凋亡活性氧類可激動細胞色素C從線粒體中釋放[23]，但活性氧類通過線粒體外膜轉運的機制及其激動細胞色素C釋放的分子機制仍不清楚。超氧陰離子(O2-)誘導的凋亡可被4，4′-二異硫氰基芪-2，2′-二磺酸和抗VDAC抗體抑制，表明O2-是通過VDAC誘導細胞色素C釋放的，此外，在VDAC重組的脂質體中也獲得的相似的結果。研究還發現，O2-可誘導VDAC表達上調，而活性氧類螯合劑沒食子兒茶素可抑制這種效應。

3VDAC和中樞神經系統疾病

VDAC參與了阿爾茨海默病的病理形成過程，但它的準確機制卻不清楚，有可能參與了β淀粉樣蛋白誘導的毒性。在阿爾茨海默病患者的腦中，VDAC在穴樣內陷的細胞膜中很豐富，因此認為VDAC可能與阿爾茨海默病神經病理性膜功能紊亂有關[24]。而對唐氏綜合征患者的尸檢發現，VDAC1表達增加。在癲癇老鼠的海馬中，VDAC1水平增加了3倍，而VDAC2降低到原來的1/4[25]。在家族性肌萎縮側索硬化癥的形成過程中，VDAC2發生了翻譯后修飾的改變[26]，且在一些患者中，過氧化物歧化酶1發生了突變，與VDAC結合后，降低了它的通道傳導性。Premkumar和Simantov[27]發現，多巴胺能降低NMB細胞中VDAC的表達，而轉染細胞表達VDAC后可減少多巴胺產生的神經毒性。在11血管阻斷的大鼠全腦缺血模型中，胞外谷氨酸鹽釋放增加，VDAC1表達顯著上調，促進凋亡[28]。

4VDAC和癌癥

癌癥細胞可通過不同的方法對抗凋亡，包括通過過度表達抗凋亡蛋白Bcl-2家族和HK來抑制線粒體凋亡通路。事實上，許多化療藥發揮化療作用就是通過誘導線粒體凋亡實現的。研究發現，人癌細胞比正常細胞表達高水平VDAC1[29]，且惡性腫瘤的線粒體可更好地結合HK，增加其抗凋亡作用，因此選擇性靶作用小分子VDAC或利用VDAC與抗凋亡蛋白相互作用來促進凋亡對抗癌藥的發展有很大的潛力。

在多種癌癥中HK和抗凋亡Bcl-2家族蛋白過表達，Bcl-2家族蛋白成員是通過與VDAC相互作用來介導它們的抗凋亡效應，靶向VDAC-Bcl-2相關也可作為抗癌藥的方法。

5VDAC和骨骼肌、心肌疾病

在營養不良的mdx小鼠的骨骼肌中，能量代謝發生了障礙，VDAC3的mRNA顯著下調，表明VDAC3可能參與了小鼠肌肉營養不良的早期病理形成。在兔心肌缺血/再灌注模型中發現，p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑PD169316能顯著減少p38介導的VDAC1磷酸化，意味著VDAC1參與了心肌缺血/再灌注[30]。

VDAC參與多種疾病的病理生理發展主要源于VDAC調節能量代謝，介導胞質和線粒體的對話以及對凋亡調節。

6小結

VDAC作為線粒體與胞質的分界，是線粒體與胞質之間物質交換的屏障以及細胞內化學或電生理信號的作用位點，在調節線粒體代謝及與細胞的其他部分聯系中起關鍵作用，通過與多種因子相互作用，調節細胞凋亡，參與多種疾病的發生發展，因此VDAC有可能成為藥物作用的新靶點。盡管已經能檢測VDAC1重組體的高分辨率結構，但仍然有許多問題未知，如調質結合位點的定位、各種VDAC亞型的具體功能及參與的疾病等，需要更深入的研究。

參考文獻

[1]Shoshan-Barmatz V,Ben-Hail D.VDAC,a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J].Mitochondrion,2012,12(1):24-34.

[2]Arbel N,Shoshan-Barmatz V.Voltage-dependent anion Channel 1-based peptides interact with Bcl-2 to prevent antiapoptotic acti-vity[J].J Biol Chem,2010,285(9):6053-6062.

[3]Yu Z,Liu N,Li Y,etal.Neuroglobin overexpression inhibits oxygen-glucose deprivation-induced mitochondrial permeability transition pore opening in primary cultured mouse cortical neurons[J].Neurobiol Dis,2013,56:95-103.

[4]De Pinto V,Guarino F,Guarnera A,etal.Characterization of human VDAC isoforms:a peculiar function for VDAC3?[J].Biochim Biophys Acta,2010,1797(6/7):1268-1275.

[5]Anflous-Pharayra K,Lee N,Armstrong DL,etal.VDAC3 has differing mitochondrial functions in two types of striated muscles[J].Biochim Biophys Acta,2011,1807(1):150-156.

[6]Wu S,Sampson MJ,Decker WK,etal.Each mammalian mitochondrial outer membrane porin protein is dispensable:effects on cellular respiration[J].Biochim Biophys Acta,1999,1452(1):68-78.

[7]Sampson MJ,Decker WK,Beaudetal,etal.Immotile sperm and infertility in mice lacking mitochondrial voltage-dependent anion Channel type 3[J].J Biol Chem,2001,276(42):39206-39212.

[8]Gauci S,Helbig AO,Slijper M,etal.Lys-N and trypsin cover complementary parts of the phosphoproteome in a refined SCX-based approach[J].Anal Chem,2009,81(11):4493-4501.

[9]Choudhary C,Kumar C,Gnad F,etal.Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions[J].Science,2009,325(5942):834-840.

[10]Mihara K,Sato R.Molecular cloning and sequencing of cDNA for yeast porin,an outer mitochondrial membrane protein:a search for targeting signal in the primary structure[J].Embo J,1985,4(3):769-774.

[11]Ujwal R,Cascio D,Colletier JP,etal.The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(46):17742-17747.

[12]Bayrhuber M,Meins T,Habeck M,etal.Structure of the human voltage-dependent anion channel[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(40):15370-15375.

[13]Hiller S,Garces RG,Malia TJ,etal.Solution structure of the integral human membrane protein VDAC-1 in detergent micelles[J].Science,2008,321(5893):1206-1210.

[14]Shoshan-Barmatz V,Golan M.Mitochondrial VDAC1:function in cell Life and death and a target for Cancer therapy[J].Curr Med Chem,2012,19(5):714-735.

[15]De Stefani D,Bononi A,Romagnoli A,etal.VDAC1 selectively transfers apoptotic Ca2+signals to mitochondria[J].Cell Death Differ,2012,19(2):267-273.

[16]Shoshan-Barmatz V,De Pinto V,Zweckstetter M,etal.VDAC,a multi-functional mitochondrial protein regulating cell Life and death[J].Mol Aspects Med,2010,31(3):227-285.

[17]Yuan S,Fu Y,Wang X,etal.Voltage-dependent anion Channel 1 is involved in endostatin-induced endothelial cell apoptosis[J].FASEB J,2008,22(8):2809-2820.

[18]Tomasello F,Messina A,Lartigue L,etal.Outer membrane VDAC1 controls permeability transition of the inner mitochondrial membrane in cellulo during stress-induced apoptosis[J].Cell Res,2009,19(12):1363-1376.

[19]Zaid H,Abu-Hamad S,Israelson A,etal.The voltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death[J].Cell Death Differ,2005,12(7):751-760.

[20]Godbole A,Varghese J,Sarin A,etal.VDAC is a conserved element of death pathways in plant and animal systems[J].Biochim Biophys Acta,2003,1642(1/2):87-96.

[21]Keinan N,Pahima H,Ben-Hail D,etal.The role of Calcium in VDAC1 oligomerization and mitochondria-mediated apoptosis[J].Biochim Biophys Acta,2013,1833(7):1745-1754.

[22]Huang H,Hu X,Eno CO,etal.An interaction between Bcl-xL and the voltage-dependent anion channel(VDAC) promotes mitochondrial Ca2+uptake[J].J Biol Chem,2013,288(27):19870-

19881.

[23]Mccommis KS,Baines CP.The role of VDAC in cell death:friend or foe?[J].Biochim Biophys Acta,2012,1818(6):1444-1450.

[24]Ramírez CM,González M,Díaz M,etal.VDAC and ERalpha interaction in caveolae from human cortex is altered in Alzheimer′s disease[J].Mol Cell Neurosci,2009,42(3):172-183.

[25]Jiang W,Du B,Chi Z,etal.Preliminary explorations of the role of mitochondrial proteins in refractory epilepsy:some findings from comparative proteomics[J].J Neurosci Res,2007,85(14):3160-

3170.

[26]Fukada K,Zhang F,Vien A,etal.Mitochondrial proteomic analysis of a cell line model of familial amyotrophic lateral sclerosis[J].Mol Cell Proteomics,2004,3(12):1211-1223.

[27]Premkumar A,Simantov R.Mitochondrial voltage-dependent anion Channel is involved in dopamine-induced apoptosis[J].J Neurochem,2002,82(2):345-352.

[28]Park E,Lee GJ,Choi S,etal.The role of glutamate release on voltage-dependent anion channels (VDAC)-mediated apoptosis in an eleven vessel occlusion model in rats[J].PLoS One,2010,5(12):e15192.

[29]Simamura E,Shimada H,Hatta T,etal.Mitochondrial voltage-dependent anion channels(VDACs) as novel pharmacological targets for anti-cancer agents[J].J Bioenerg Biomembr,2008,40(3):213-217.

[30]Schwertz H,Carter JM,Abdudureheman M,etal.Myocardial ischemia/reperfusion causes VDAC phosphorylation which is reduced by cardioprotection with a p38 MAP kinase inhibitor[J].Proteomics,2007,7(24):4579-4588.

Research Progress in Voltage-dependent Anion ChannelDAIQiong-yan，DUANMan-lin.(DepartmentofAnesthesia，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China)

Abstract:Found at the outer mitochondrial membrane,the voltage-dependent anion channel(VDAC) forms the main interface between the mitochondria and cellular metabolisms,thus functions as a gatekeeper,controlling cross-talk between mitochondria and the rest of the cell.Meanwhile,VDAC has also been recognized as a key protein in mitochondria-mediated apoptosis.In addition to regulating the metabolic and energetic functions of mitochondria,VDAC appears to be a convergence point for cell survival and cell death signals via its association with various ligands and proteins,making it to be a rational target for new therapeutics.Here is to make a review of mammalian VDAC,especially VDAC1,addressing its structure,functions,the relationship between associated proteins and its involvement in several diseases.

Key words：Voltage-dependent anion channel; Mitochondria; Apoptosis

收稿日期：2014-09-28修回日期：2014-12-23編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.011

中圖分類號：R966

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)13-2332-03