微RNA在眼部疾病中的研究進展

張萬紅(綜述)，焦慧英(審校)

(天津市泰達醫院眼科，天津 300457)

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微RNA在眼部疾病中的研究進展

張萬紅(綜述)，焦慧英※(審校)

(天津市泰達醫院眼科，天津 300457)

摘要：微RNA(microRNA)為生物體內內源性小分子RNA，由約22個單核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子構成。microRNA參加生物體內多種生物學功能，包括轉錄調節、能量代謝、生長發育、繁殖及相關病例生理過程。microRNA是生物(包括人)體內重要的生物調節小分子，在體內行使多種生物學功能。近年來研究顯示，microRNA在眼科疾病中同樣發揮重要作用。因此，隨著microRNA及眼科相關疾病的研究逐步深入，micorRNA有望成為眼科相關疾病的診斷與治療開辟新的領域。

關鍵詞：眼部疾病；微RNA；作用機制

微RNA(microRNA)是生物體內一類特殊的RNA分子，它由長度為22個核苷酸左右的非編碼單鏈RNA 分子構成，microRNA在動植物中參與轉錄后基因表達調控。大多數microRNA 以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于細胞中。研究發現，microRNA參與人類各種生命活動的調節，例如發育、病毒防御、器官形成等[1]。最近的研究發現，RNA小干擾技術在眼科領域中有較大的潛在作用[2]，現就RNA小干擾技術近年來在眼科疾病中的應用及未來應用方向進行綜述。

1microRNA的發現

20世紀90年代，Lee等[3]首先對一種簡單的多細胞生物——秀麗桿線蟲進行研究時發現該生物體內存在一種內源性小分子單鏈RNA(被命名為lin-4)。lin-4 由22個核苷酸組成，本身沒有開放的閱讀框，因而無法編碼蛋白質。但進一步的研究發現，lin-4參與秀麗桿線蟲的幼蟲到成蟲的發育過程，其作用機制可能與其抑制核蛋白體lin-14有關[4]。大多數學者認為是因為lin-14編碼的小分子RNA 3′非編碼區擁有上游調控序列與lin-4存在單核苷酸互補序列，從而造成上游轉錄調控機制發生改變，抑制了RNA聚合酶與lin-14的結合，進而降低了其表達水平[4]。5年后相似功能的microRNA被陸續發現，包括microRNA-let-7等[5-6]。此后，隨著高通量測序、生物信息學等技術的發展，大量microRNA被陸續發現。

2microRNA作用機制

自1990年有研究者[7]將產生色素的DNA置于強啟動子再導入牽牛花試圖加深花朵紫色，但結果未見到深紫色花朵反而變成了白色，因此該研究者首先將這種現象命名為協同抑制，這種現象的發生不僅存在于植物牽牛花中，同時在真菌中也得到了證實，但當時各國學者并未關注。后續關于秀麗干線蟲的實驗表明，線蟲消化道中注入雙鏈DNA可以阻斷線蟲同源基因表達，還可導致同源基因沉默，后來稱這種現象為RNA干擾[8]，并逐漸被關注。RNA的干擾過程可以在多種生物細胞(如昆蟲、線蟲、植物甚至于人體)中存在，此現象說明RNA干擾并非偶然而是在生命長期進化過程中產生的防御系統。RNA干擾現象成為許多學者研究的熱點，RNA干擾作用機制并未明確，但經過大量研究總結其認同的機制有如下幾點。由外源導入或病毒感染等引入雙鏈RNA，并同雙鏈RNA特異性核酸內切酶，即DICER酶-RNaseⅢ中的特異性核酸內切酶[9](包含1個N端RNA解旋酶、1個PAZ結構域、2個 RNA酶Ⅲ結構和1個末端雙鏈RNA)相互作用。Dicer一般作用于長度為200~500 bp 雙鏈RNA的末端，產生21~23 nt microRNA(小干擾RNA)，每個小干擾RNA末端均有核苷，Dicer酶通過PAZ結構域同Argonaute相互作用。核酸內切酶同Argonaute相連，再同小干擾RNA結合形成多個亞單元核苷酸復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC解旋酶使用ATP將小干擾RNA雙鏈解開，將同源信使RNA同小干擾RNA反義鏈互補。RISC將信使RNA降解并使其在細胞和機體內表達水平下降，從而降低或喪失其功能。此外，microRNA還可以進行表觀遺傳學修飾，包括組蛋白修飾(甲基化，乙酰化等)，DNA甲基化以及基因印跡等，從而使下游相關基因功能加強或降低來調控細胞和機體的生物學行為。

3microRNA在眼科疾病中的應用

由于內源性microRNA存在眾多生物學功能，因而采用腺病毒或脂質體轉染試劑包裝的外源性microRNA轉染哺乳動物，可在動物體內發揮類似內源性microRNA的作用。該研究方法是目前microRNA研究的方向和重點[10]。同時眼是人體相對獨立的組織器官，在一定情況下不受機體免疫功能的監控和影響，因而給microRNA的治療提供了較大空間。Mysara等[11]的研究中，將小干擾RNA于玻璃體中注射，很快可在眼組織中擴散，且維持時間久，對其他組織影響小。利用RNA干擾治療可有效沉默眼部基因，避免其他部位同種基因的“脫靶”效應，這也為眼部“基因敲除”提供有效途徑。

3.1microRNA與眼科新生血管性疾病血管性疾病在眼科較為常見，也是導致患者視力發生改變的重要原因之一。有學者發現了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與多種眼科血管增生性疾病有關，同時進一步的研究顯示，通過單克隆抗體抑制VEGF的表達或其內源性活性可以提高患者的視力水平[12]。動物研究顯示，將外源性表達VEGF/小干擾RNA采用腺病毒包裝后在大鼠視網膜細胞進行注射，通過免疫檢測發現靶向小干擾RNA可有效減少VEGF在脈絡膜的表達[13]。隨后他們在觀察脈絡膜的破裂并誘導新生血管生成的實驗中發現，應用VEGF小干擾RNA治療眼新生血管面積顯著高于熒光蛋白組，說明靶向小干擾RNA抑制VEGF可減少脈絡膜血管新生。Takeuchi等[14]進行了相應的實驗檢測VEGF小干擾RNA在動物體內的安全性，通過檢查視網膜熒光造影，觀測激光光凝后的破裂脈絡膜發現，VEGF小干擾RNA對視網膜電圖并無影響。一次玻璃體內注射可抑制脈絡膜新生血管形成，持續效果30 d以上，與對照組比較差異有統計學意義。

3.2microRNA與眼科纖維增生性疾病傷口過度修復會形成組織瘢痕纖維化，并發相關眼科疾病。研究表明，良好的濾過通道是青光眼手術的關鍵，纖維細胞過度增生使濾過泡瘢痕化是青光眼手術失敗的重要原因，所以抑制瘢痕增生是研究重點[6]。轉化生長因子β是轉化生長因子的一個亞型，于傷口愈合瘢痕形成中起重要作用。Chang和Wu[15]采用靶向轉化生長因子β2型受體的小干擾RNA培養的人角膜成纖維細胞，可有效抑制轉化生長因子β表達和結膜下炎性細胞的沉積。

3.3microRNA與細胞凋亡性眼病神經節細胞變形凋亡是青光眼和視神經損傷后喪失視力的主要原因。Wallace和Cotter[16]將凋亡激酶活化因子1的靶向小干擾RNA注射到視神經殘端觀測神經節細胞的存活，結果凋亡激酶活化因子1靶向小干擾RNA促進了視網膜神經節細胞的存活，但Bax靶向小干擾RNA并未對橫斷的視網膜細胞數量產生影響。故可以利用凋亡激酶活化因子1基因在視網膜神經細胞凋亡過程的促進作用進行RNA干擾降低細胞凋亡。

3.4microRNA與氧化損傷性眼病氧化損傷是造成多種眼病的重要原因，如白內障、視網膜色素變性等。Yeh等[17]通過培養p66Shc靶向小干擾RNA，可抵抗因為H2O2引起的視網膜上皮細胞氧化損傷，他們通過觀察視網膜電圖證實了這種小干擾RNA對于視網膜具有保護作用。Nakatsugawa等[18]用RNA干擾晶狀體上皮中蛋氨酸亞砜還原酶基因A的表達，發現晶狀體上皮細胞容易受到氧化損傷，但過度表達蛋氨酸亞砜還原酶基因可減少氧化損傷，說明RNA干擾可作為分析基因功能的有效途徑。

3.5microRNA與視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤是嬰幼兒時期的常見惡性腫瘤。視網膜母細胞瘤的病理發展過程中，VEGF為腫瘤的新生起重要作用。可以通過RNA干擾造成基因沉默抑制新生血管的生長，從而控制腫瘤。Jia等[19]在視網膜母細胞瘤株中觀察到了小干擾RNA對VEGF具有抑制效果，再將腫瘤細胞株接種到大鼠皮下，于瘤體內注射抗VEGF的小干擾RNA發現該類瘤體內局部應用小干擾RNA可顯著抑制VEGF表達，在治療1周后，VEGF小干擾RNA的瘤體體積減少了67%，這可能成為今后基因治療視網膜母細胞瘤的新方向。

3.6microRNA與促進視神經再生視神經是中樞神經，軸突損傷后神經節的存活或再生是近年研究重點。研究發現，視神經所處微環境中存在3種抑制因子，但它們均通過共同受體——抑制分子受體發揮抑制作用[20-22]。對成年大鼠髓鞘蛋白進行主動免疫后，被夾傷的視神經可顯著再生，但構成髓鞘蛋白的有效成分難以確定[23]。但可以確定的是，目前針對抑制分子受體的單克隆抗體可中和髓鞘中的抑制蛋白作用，加速體外神經元再生，但難以在體內作用。既往的一項研究中，通過對腺病毒攜帶的抑制分子受體小干擾RNA進行轉染后可抑制抑制分子受體表達，并促進受損視神經軸突再生[24]。

4結語

目前RNA干擾現象在人類多種慢性疾病及惡心腫瘤中發揮重要作用，microRNA在人類疾病的病因、診斷及治療方面有廣闊的應用前景。而眼部組織結構特殊，一直是作為基因治療的理想器官。雖然目前RNA干擾技術于眼科疾病的治療方面尚處于實驗階段，但隨著RNA干擾技術的完善與發展，以及該技術在其他領域中的成功應用預示RNA干擾同樣會在眼科治療中得到更多應用[25]，并為眼科學的發展提供有力的分子生物學工具。

參考文獻

[1]van Rooij E,Kauppinen S.Development of microRNA therapeutics is coming of age[J].EMBO Mol Med,2014,6(7):851-864.

[2]張麗娟，張琰，東莉潔，等.microRNA在眼部的表達及其功能[J].中華眼科雜志，2012，48(12)：1136-1140.

[3]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[4]Moss EG,Lee RC,Ambros V.The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C.elegans and is regulated by the lin-4 RNA[J].Cell,1997,88(5):637-646.

[5]Johnson SM,Lin SY,Slack FJ.The time of appearance of the C.elegans let-7 microRNA is transcriptionally controlled utilizing a temporal regulatory element in its promoter[J].Dev Biol (N Y 1985),2003,259(2):364-379.

[6]Dunmire JJ,Lagouros E,Bouhenni RA,etal.microRNA in aqueous humor from patients with cataract[J].Exp Eye Res,2013,108:68-71.

[7]van Kouwenhove M,Kedde M,Agami R.microRNA regulation by RNA-binding proteins and its implications for cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(9):644-656.

[8]楊媛,王蒙,粟永萍,等.RNAi作用機制研究進展及其應用[J].免疫學雜志,2005,21(6):543-545.

[9]韓磊,張安玲,岳曉,等.RNA干擾敲低Dicer對膠質瘤細胞惡性表型的影響[J].中華神經外科雜志,2011,27(2):131-135.

[10]Liu JL,Wang Y,Jiang J,etal.Inhibition of survivin expression and mechanisms of reversing drug-resistance of human lung adenocarcinoma cells by siRNA[J].Chin Med J (Engl),2010,123(20):2901-2907.

[11]Mysara M,Elhefnawi M,Garibaldi JM,etal.My siRNA:Improving siRNA efficacy prediction using a machine-learning model combining multi-tools and whole stacking energy (ΔG)[J].J Biomed Inform,2012,45(3):528-534.

[12]Won YW,Lee M,Kim HA,etal.Post-translational regulated and hypoxia-responsible VEGF plasmid for efficient secretion[J].J Control Release,2012,160(3):525-531.

[13]Lamoke F,Labazi M,Montemari A,etal.Trans-Chalcone prevents VEGF expression and retinal neovascularization in the ischemic retina[J].Exp Eye Res,2011,93(4):350-354.

[14]Takeuchi A,Takeuchi M,Oikawa K,etal.Effects of dioxin on vascular endothelial growth factor (VEGF) production in the retina associated with choroidal neovascularization[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(7):3410-3416.

[15]Chang Y,Wu XY.The role of c-Jun N-terminal kinases 1/2 in transforming growth factor beta(1)-induced expression of connective tissue growth factor and scar formation in the cornea[J].J Int Med Res,2009,37(3):727-736.

[16]Wallace DM,Cotter TG.Histone deacetylase activity in conjunction with E2F-1 and p53 regulates Apaf-1 expression in 661W cells and the retina[J].J Neurosci Res,2009,87(4):887-905.

[17]Yeh YT,Lee CI,Lim SH,etal.Convergence of physical and chemical signaling in the modulation of vascular smooth muscle cell cycle and proliferation by fibrillar collagen-regulated P66Shc[J].Biomaterials,2012,33(28):6728-6738.

[18]Nakatsugawa M,Hirohashi Y,T origoe T,etal.Novel spliced form of a lens protein as a novel lung cancer antigen,Lengsin splicing variant 4[J].Cancer Sci,2009,100(8):1485-1493.

[19]Jia RB,Zhang P,Zhou YX,etal.VEGF-targeted RNA interference suppresses angiogenesisand tumor growth of retinoblastoma[J].Ophthalmic Res,2007,39(2):108-115.

[20]Tzenov YR,Andrews PG,Voisey K,etal.Human papilloma virus (HPV) E7-Mediated attenuation of retinoblastoma (Rb) induces hPygopus2 expression via Elf-1 in cervical cancer[J].Mol Cancer Res,2013,11(1):19-30.

[21]Arai M,Genda Y,Ishikawa M,etal.The miRNA and mRNA changes in rat hippocampi after chronic constriction injury[J].Pain Med,2013,14(5):720-729.

[22]O′Donnell JM,Kalichira A,Bi J,etal.In vivo,cardiac-specific knockdown of a target protein,malic enzyme-1,in rat via adenoviral delivery of DNA for non-native miRNA[J].Curr Gene Ther,2012,12(6):454-462.

[23]Pushparaj PN,Aarthi JJ,Manikandan J,etal.siRNA,miRNA,and shRNA:in vivo applications[J].J Dent Res,2008,87(11):992-1003.

[24]Xu S,Liu M,Zhang T,etal.Effect of lentiviral shRNA of Nogo receptor on rat cortex neuron axon outgrowth[J].Can J Neurol Sci,2011,38(1):133-138.

[25]Gessert S,Bugner V,Tecza A,etal.FMR1/FXR1 and the miRNA pathway are required for eye and neural crest development[J].Dev Biol,2010,341(1):222-235.

致作者：

1.文章中使用縮略語、略稱、代號時，在首次出現時必須加注中文并寫出英文全稱，如：肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)。

2.參考文獻的書寫要規范(包括標點符號)，格式如下：

①期刊： 作者.文題[J].刊名，年，卷(期)：起-止頁碼.

②專著： 著者.書名[M].版次.出版地：出版者，出版年：起-止頁碼.

Research Progress on MicroRNA in Eye DiseasesZHANGWan-hong，JIAOHui-ying.(DepartmentofOphthalmology,TianjinTEDAHospital,Tianjin300457,China)

Abstract:MicroRNA(miRNA) is a kind of endogenous small RNAs in organisms,consisting of about 22 nucleotides around noncoding single-stranded RNA molecules.It has been revealed that miRNA involves in a variety of biological functions,including transcriptional regulation,energy metabolism,growth,reproduction and related cases of physiological processes.MiRNA is an important small molecule in biological organisms(including human),acting on a variety of biological functions.Recent studies have shown it also plays an important role in eye diseases.Therefore,as the study on miRNA and eye disease develops,miRNA may bring new direction for the diagnosis and treatment of eye diseases.

Key words:Eye diseases; MicroRNA; Mechanism

收稿日期：2014-06-19修回日期：2014-11-17編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.020

中圖分類號:R771.3

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)13-2356-03