結核病實驗室診斷研究新進展

吳艷華,王茂水(綜述)，李　霞(審校)

(1.　山東省醫學科學院基礎醫學研究所，濟南 250062； 2.濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命學院，濟南 250200；

3.山東省胸科醫院檢驗科，濟南 250013)

結核病實驗室診斷研究新進展

吳艷華1,2,3△,王茂水3(綜述)，李霞1※(審校)

(1.山東省醫學科學院基礎醫學研究所，濟南 250062； 2.濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命學院，濟南 250200；

3.山東省胸科醫院檢驗科，濟南 250013)

摘要：隨著分析技術的不斷進步以及對結核桿菌致病機制研究的深入，結核病的實驗診斷在分子標志物、結核抗體、核酸檢測、γ干擾素釋放試驗和診斷模型等方面取得了很大的進步，極大豐富了結核病實驗室診斷手段。這些實驗手段的應用，為結核病的診斷提供了較好的選擇方案。盡管如此，這些新手段仍僅作為輔助手段，不能完全替代涂片與培養等傳統手段。因此，仍然有必要繼續開展相關研究，以推動結核病的實驗室診斷水平。隨著分析技術的不斷進步和結核病分子機制的深入探討，相信會有更好的標志物或診斷手段進入臨床并得以應用。

關鍵詞：結核病；診斷；標志物；試驗

結核病是目前最嚴重的傳染病之一，依據世界衛生組織(WHO)2013年全球結核報告，2012年約有860萬例新發結核病患者，約130萬例患者死亡。隨著艾滋病的流行與耐多藥結核的出現，結核病的控制難度不斷增加。長期以來，結核病實驗室診斷手段依然依賴于涂片、培養等。這些方法往往具有陽性率低、耗時等缺點。為有效控制結核病，有必要尋找新標志物以及建立新型的結核病實驗室診斷手段。現就近年分子標志物、結核抗體、核酸檢測和干擾素γ釋放試驗等在結核病診斷中的新進展予以綜述。

1診斷標志物

1.1結核抗原由于當前分析手段靈敏度與結核抗原含量低的問題，可用于診斷的結核抗原較少。新近發現，結核抗原Rv3803c和Rv2626c在診斷活動性肺結核方面具有極好的診斷價值[1]。目前研究較多的是結核桿菌的表面抗原脂質阿拉伯甘露聚糖，研究表明尿脂質阿拉伯甘露聚糖的檢測可用于艾滋病患者并發結核病診斷，由于檢查的無創性，極具前景[2]。研究表明，其靈敏度為13%～93%，特異度為87%～99%。另外，誘導痰脂質阿拉伯甘露聚糖的檢測也有助于艾滋病患者并發結核病的診斷[3-4]。當前，基于尿液脂質阿拉伯甘露聚糖檢測的即時檢驗試劑盒已上市，其在艾滋病并發結核病患者中的診斷價值被廣泛評價，具有較好的前景。

1.2宿主反應相關蛋白結核桿菌侵入人體后，會與宿主之間產生相互作用，在此過程中機體會發生一系列免疫學改變，如細胞因子水平、急性時相蛋白的改變等，而這些改變可以作為結核病的診斷標志物。如胸腔積液白細胞介素27在診斷結核性胸腔積液方面具有較好的價值(靈敏度為92.7%，特異度為99.1%)[5]； 干擾素γ在診斷結核性腹膜炎方面也極具價值[受試者工作特征藥時曲線下面積(AUC)為0.99][6]；血清C反應蛋白在結核病患者中的水平(中位數57.8 mg/L)遠高于非結核患者(6.4 mg/L)，同時研究表明，當C反應蛋白水平≥50 mg/L，疾病預后較差，患者具有較高的結核桿菌負荷量、易播散和高死亡風險[7]；另有研究表明，血清人附睪上皮分泌蛋白4在區分肺癌與肺結核方面具有較好的靈敏度(61.6%)和特異度(93.0%)[8]。最近，有學者應用蛋白質譜技術研究活動性肺結核病患者的血清診斷標志物發現，纖維蛋白原在結核病患者中水平升高，提示其可用于結核病的診斷[9]。

1.3可揮發化合物結核感染后，機體在呼氣時會產生特異的揮發性有機化合物，隨著氣質聯用技術的進步，揮發性有機化合物檢測成為可能[10]。通過檢測萘、苯和烷烴等的衍生物含量，建立診斷模型，發現其在結核病診斷中的靈敏度為71.2%，特異度為72%，AUC為0.80[11]。

1.4微小核糖核酸近年來，隨著對微RNA(micro RNA,miRNA)研究的不斷深入，發現其在機體的免疫反應中具有重要作用。已有研究探索血清微小核糖核酸譜的變化，發現59個miRNA下調，33個miRNA上調，同時表明miRNA-29a可成為結核病診斷標志物[12]。另外，Yi等[13]還發現痰中微小核糖核酸譜也有改變。其他研究顯示，血清miRNA-361-5p、miRNA-889和miRNA-576-3可以用于區分結核感染者與健康者或其他微生物感染者，這3種miRNA AUC介于0.711～0.848，而當三者聯合時，AUC可提高至0.863[14]。miR-155*和miR-155也具有較好的診斷價值，其中miR-155的AUC為0.8972，miR-155*的AUC為0.7945，同時研究發現這兩種分子標志物與結核抗原的表達密切相關，提示可能具有一定局限性[15]。

2結核抗體的研究進展

一項Meta分析顯示，抗結核抗體檢查具有較大的不穩定性，各種測試之間差異較大[16]。目前研究傾向于采用聯合抗原檢測抗結核抗體，這可有效避免個體之間抗原反應的異質性，而單抗原檢測結核抗體時，各種抗原存在較大差異。如某研究評估18種結核抗原結核抗體檢測，發現靈敏度為55.7%～82.9%，特異度為62.0%～92.2%，同時發現聯合抗原檢測有助于提高結核抗體檢測性能[17]；又如某研究比較了4種脂酶(LipY、Rv0183、Rv1984c和Rv3452)用于結核抗體檢測，靈敏度為73.4%～90.5%，特異度為93.9%～97.5%，Rv3452性能最佳[18]；某研究評估早期分泌靶抗原6、培養濾液蛋白、早期分泌靶抗原6分泌1系統底物蛋白C、14×103/38×103融合蛋白和早期分泌靶抗原6/14×103/38×103融合蛋白等結核抗原，發現靈敏度為69.4%～77.6%，特異度為78.4%～90.2%[19]；一項Meta分析發現,結核桿菌分泌的MPT64蛋白在結核抗體檢測中具有較好應用價值[20]。Zhu等[21]研究表明，MPT64蛋白抗體檢測靈敏度為64.4%，特異度為99.4%，AUC為0.819。

3核酸檢測

結核桿菌核酸檢測可分為定性與定量檢測。定性，如多重聚合酶鏈反應和巢式聚合酶鏈反應；定量，如實時聚合酶鏈反應。這些方法在結核病診斷方面差異不大，均具有較好的靈敏度和特異度[22]。當前該技術的研究熱點集中在靶點序列的選擇以及多種聚合酶鏈反應技術的比較等方面。研究較多的靶點序列主要有插入序列6110(insertion sequence 6110,IS6110)、MPB64基因、參與編碼L-絲氨酸脫氫酶的Rv0069c(L-serine dehydratase Rv0069c,sdaA)、Rv3133c、RNA聚合酶β亞基基因(β-subunit of RNA polymerase,rpoB)、熱激蛋白65基因(heat-shock protein 65,hsp65)和16S 核糖體RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)等。

結核桿菌核酸檢測技術具有較好的檢測性能，如全血樣本的多重聚合酶鏈反應檢測技術(IS6110和MPB64)，其靈敏度為95.7%、特異度為100%[23]；聚合酶鏈反應檢測sdaA序列，并與其他序列引物比較(如Rv3133c，IS6110，MPB64，rpoB)，sdaA聚合酶鏈反應的特異度為96.5%、靈敏度為95.9%，與其他引物相比，sdaA-聚合酶鏈反應具有一定優勢[24]；巢式聚合酶鏈反應檢測hsp65序列，靈敏度為100%(結核分枝桿菌培養陽性患者)和95.0%(抗酸桿菌涂片陽性患者)，特異度為93.1%[25]；多重聚合酶鏈反應(基于16SrRNA、IS6110和Rv3133c等序列)靈敏度為97.5%[26]。

評價較多的結核桿菌核酸檢測試劑盒有：羅氏公司的Applicor法和TaqMan法試劑盒，Cepheid公司的GeneXpert(GX)系統。有研究比較Applicor法與TaqMan法，發現在呼吸道標本中TaqMan法要優于Applicor法，兩者符合率達到98.2%[27]。在隨后進行的前瞻性研究中，發現TaqMan法在呼吸道標本中靈敏度為88.4%、特異度為98.8%，在非呼吸道標本中，靈敏度為63.6%、特異度為94.6%[27]。另一研究也證實TaqMan法具有較好的性能，發現TaqMan實時定量聚合酶鏈反應法在呼吸道標本中的靈敏度為82.7%(結核分枝桿菌培養陽性患者)和34.9%(抗酸桿菌涂片陰性患者)，特異度為96.5%[28]。

GeneXpert MTB/RIF系統是一款基于實時定量聚合酶鏈反應技術的儀器，可用于結核桿菌檢測和利福平耐藥。一項Meta分析顯示，該技術在結核病診斷方面具有較好的靈敏度和特異度[29]。它是一種準確度高、容易操作、快速的結核桿菌檢測方法。如在活動性肺結核中，GeneXpert MTB/RIF系統的診斷靈敏度為79.5%、特異度為100.0%[30]。研究顯示，GeneXpert MTB/RIF系統在結核性腦膜炎、生殖結核、淋巴結核、兒童肺結核等疾病中均有不錯表現。該檢測的樣本來源廣泛，如全血樣本、纖維支氣管鏡樣本、鼻咽拭子等。但在抗結核治療評價方面，其具有一定局限性。

4干擾素γ釋放試驗

目前，基于干擾素γ釋放原理的試劑盒有德國凱杰公司的全血干擾素γ釋放試驗試劑盒(QuantiFERON-TB Gold)和英國Oxford Immunotec公司的結核感染T細胞檢測試劑盒(T-SPOT.TB)。兩者原理相似，差異在于干擾素γ的檢測方式不同，一種是檢測干擾素γ的水平，一種是計數分泌干擾素γ的細胞數量。研究顯示，兩者在結核感染診斷方面性能相當，差異較小[31]。但是在結核感染高負擔區域，干擾素γ釋放試驗并不準確，這是由于潛伏感染者，也會呈現陽性，該測試僅被批準用于結核感染的判斷，而非活動性結核病，且證據并不支持其可以用于常規測試。盡管如此，干擾素γ釋放試驗還是展現了較好的應用前景。

比較結核菌素試驗和全血干擾γ素釋放試驗在活動性肺結核中診斷價值時，發現全血干擾素γ釋放試驗的靈敏度為80%，而結核菌素試驗的靈敏度為28%，表明全血干擾素γ釋放試驗與結核菌素試驗相比，具有更好的靈敏度，且其不受卡介苗與非結核分枝桿菌的影響[32]。我國學者發現，在骨結核診斷方面，結核感染T細胞檢測的靈敏度為94.2%，而涂片檢查僅為19.7%，定量聚合酶鏈反應檢查僅為36.8%，培養為34.2%[33]。提示與其他檢查相比，結核感染T細胞檢測更有助于骨結核的診斷。

5其他技術

5.1外周血淋巴細胞抗體分泌試驗外周血淋巴細胞抗體分泌試驗通過檢測離體細胞分泌的特異度抗體，達到間接診斷病原體感染的目的。Raqib等[34]率先將該技術引入結核病診斷，并取得不錯的研究結果。該法在活動性肺結核診斷中，靈敏度可達90%，特異度可達88%[35]。另外，該法在兒童結核病的診斷中也取得了不錯的結果[36]。但是該法對非結核疾病組與結核病之間區分能力較差。

5.2預測模型目前，多項研究評價預測模型或賦分系統在結核病鑒別診斷中的應用均有較好的表現，如Neves等[37]提出的結核性胸腔積液的診斷模型，其特異度和靈敏度均可達到95%以上；Sun等[38]制作的賦分模型在鑒別結核性胸腔積液與非結核性胸腔積液方面，靈敏度可達90.1%，特異度為94.3%，準確度為92.1%；Soto等[39]制作的賦分模型在鑒別涂陰肺結核方面，AUC為0.83，具有更好的鑒別診斷價值。

6展望

隨著分析手段的不斷進步以及對結核病致病機制研究的不斷深入，相信會有越來越多的標志物或者實驗手段進入臨床。這些標志物與診斷手段的總體發展趨勢應該是簡單、快速、廉價、準確。盡管現有的結核病實驗室檢測手段種類繁多，但是仍然沒有哪一種手段可以替代涂片與培養，因此仍然有必要繼續開展相關研究，尋找一種性價比更高的實驗室診斷手段。

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Recent Research onLaboratoryDiagnosis of Tuberculosis

WUYan-hua1,2,3,WANGMao-shui3,LIXia1.

(1.InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China; 2.UniversityofJinan,ShandongAcademyofMedicalandLifeScience,Jinan250200,China; 3.DepartmentofLaboratoryMedicine,ShandongProvincialChestHospital,Jinan250013,China)

Abstract:With the advancement of analytical technology and development of pathogenesis in Mycobacterium tuberculosis(TB) infection,the TB laboratory diagnosis has made great progress in molecular markers,serological tests,nucleic acid amplification,IFN-γ release assays and diagnostic model in the past few years.Although these diagnostic methods have improved the level of TB diagnosis,it only can be used as an adjunct tool and cannot completely replace the traditional methods,such as smear and mycobacterial culture.Therefore,there is still a need to carry out research to promote the laboratory diagnosis of tuberculosis.In the future,under the help of analytical technology and mechanism of TB infection,it′s believed that more and more diagnostic methods will be introduced into clinical practice.

Key words:Tuberculosis; Diagnosis; Marker; Trial

收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-07-17編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.035

中圖分類號：R446.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)04-0666-04