重樓皂苷Ⅶ聯合順鉑通過內質網應激誘導卵巢癌細胞凋亡

張嘉玲，鄭長軍，楊瑞琦，王　飛，范麗梅

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

重樓皂苷Ⅶ聯合順鉑通過內質網應激誘導卵巢癌細胞凋亡

張嘉玲，鄭長軍，楊瑞琦，王飛，范麗梅*

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0006)

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率逐年上升，嚴重威脅著女性健康[1]。傳統的手術治療雖可以切除腫瘤病灶，但殘存的癌細胞則可以引起腫瘤的復發與轉移；而放化療因其本身存在的嚴重毒副作用和耐藥性，使其臨床應用受到了很大限制[2，3]。近年來，隨著分子生物學、中藥化學等的發展，應用中藥有效成分治療來清除病灶成為腫瘤治療領域的發展趨勢。重樓(Paris polyphylla Smith var.Yunnannensis)為百合科重樓屬植物的干燥根莖，極具藥用價值；而重樓皂苷Ⅶ是重樓中的主要有效成分，其能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡[4-6]。以鉑類為基礎的聯合化療是腫瘤的標準化療方案，順鉑主要通過損傷腫瘤細胞的DNA結構產生抗癌作用，已在臨床上廣泛應用；因此，我們推測聯合重樓皂苷Ⅶ與順鉑可有效的治療卵巢癌。我們前期實驗已證實重樓皂苷Ⅶ對A549細胞的增殖有明顯抑制作用，說明重樓皂苷Ⅶ具有良好的抗腫瘤效應，其機制可能是通過Keap1-Nrf2-ARE信號通路介導的；但是，重樓皂苷Ⅶ是否能有效治療卵巢癌還有待探索。本研究將聯合重樓皂苷Ⅶ和順鉑處理卵巢癌細胞SKOV3，并探索其相關分子機制，為卵巢癌的治療提供實驗基礎。

1材料與方法

1.1　重樓皂苷Ⅶ的制備

取干燥的重樓塊根，粉碎，稱100 g樣品，加70%的乙醇800 ml回流提取3次，每次2 h，過濾，合井濾液，減壓濃縮至浸膏。加水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙醋萃取，除去親脂性的成分，再用正丁醇萃取，正丁醇部分減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥為粉末狀，反復用乙醇溶解-丙酮沉淀3次，最后將沉淀再次冷凍干燥，得淺棕色粉末，即為重樓皂苷。最后用高效液相分離得到重樓皂苷Ⅶ，成份經省藥監局鑒定純度達99.9%。

1.2　MTT法檢測SKOV3細胞增殖

SKOV3細胞購自美國ATCC細胞庫，在含 10%胎牛血清中的 IMDM培養液中，5%CO2，37℃細胞培養箱中培養。細胞傳代3-5代后取對數生長期細胞，配制成濃度為1×105/ml的細胞懸液，以每孔200 μl的體積接種于 96孔板中。培養24 h后加入不同濃度的重樓皂苷Ⅶ和順鉑處理細胞：0.1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑、1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑、10 μg/ml重樓皂苷Ⅶ + 1 μg/ml 順鉑，并設置空白對照組，每組設3個復孔。在上述條件下繼續培養24 h和48 h后，每孔加入用無血清培養液配制的MTT 100 μl，使終濃度為0.5 mg/ml，繼續培養4 h后，每孔加100 μl DMSO 終止反應，振蕩混勻，用酶標儀測定其吸光度(A570)值。試驗重復3次，取平均值。生長抑制率(%)=(對照組 OD值-用藥組OD值)/對照組OD值×100%。

1.3　Hoechst染色檢測細胞凋亡

SKOV3細胞按1×105個/孔接種于24孔板中(孔板中事先鋪上1 cm×1 cm的玻片)，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養箱中培養24 h。待細胞達到80%左右融合時，加入受試藥物：0.1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑、1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑、10 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑，繼續培養24 h。棄掉培養液，PBS洗滌3遍，加入Hoechst 33258染料，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養箱避光染色10 min。PBS洗滌玻片3次，共聚焦顯微鏡下觀察細胞核的染色情況。

1.4　Real-time PCR

對數生長期SKOV3細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA。Caspase3、XBP1、ATF4、GAPDH基因引物見表1。使用TAKARA公司的SYBR Green染料按說明書配制PCR反應液，置Real-time PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃，2 min預變性，然后按93℃，1 min，55℃，1 min，72℃，1 min，共做40個循環，最后72℃，10 min延伸。結果以GAPDH為內參，2-△△CT法計算各基因相對表達量。

表1　Real time-PCR各基因引物序列

1.5　統計學分析

2結果

2.1　細胞增殖率

SKOV3細胞用不同濃度重樓皂苷Ⅶ和順鉑處理24h和48h后，MTT法檢測細胞增殖受到不同程度的影響。0.1μg/ml重樓皂苷Ⅶ和1μg/ml順鉑組對細胞增殖有輕微影響，而1μg/ml重樓皂苷Ⅶ 和1μg/ml順鉑組，以及10μg/ml重樓皂苷Ⅶ組對細胞增殖影響較大，與對照組相比有統計學差異(P<0.05，圖1)。

圖1MTT檢測重樓皂苷Ⅶ聯合順鉑處理SKOV3細胞增殖率，隨重樓皂苷Ⅶ濃度增加，細胞增殖率降低，且48h較24h增殖率低。*P<0.05。

2.2　細胞凋亡率

為檢測SKOV3細胞增殖抑制是否是由凋亡引起，在同樣的藥物處理48 h后，我們用Hoechst染色檢測了細胞的凋亡率。實驗結果發現0.1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ和1 μg/ml 順鉑組中藍色的凋亡細胞較對照組多，但兩組間無統計學差異(P>0.05)，但1 μg/ml和10 μg/ml重樓皂苷Ⅶ組中調亡細胞較多，相比對照組而言有明顯的統計學差異(P<0.05)，且存在劑量依賴性(圖2)。說明經重樓皂苷Ⅶ和順鉑處理后，卵巢癌細胞會經凋亡死亡。

2.3　Caspase3、XBP1和ATF4基因表達變化

為分析SKOV3細胞凋亡的分子機制，我們檢測了凋亡相關基因caspase3，內質網應激相關基因XBP1和ATF4的表達變化。實驗結果發現藥物處理會使caspase3基因表達上調，進而促進腫瘤細胞凋亡。同時，XBP1和ATF4基因的表達也上升了(圖3)，證明細胞凋亡是由內質網應激引起的。我們的實驗為治療卵巢癌提供了靶位點，即可從緩解內質網應激入手。

圖2Hoechst染色檢測重樓皂苷Ⅶ聯合順鉑處理SKOV3細胞凋亡率，隨重樓皂苷Ⅶ濃度增加，細胞凋亡率增加。A：0.1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ + 1 μg/ml 順鉑；B：1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ + 1 μg/ml 順鉑；C：10 μg/ml重樓皂苷Ⅶ +1 μg/ml 順鉑。*P<0.05。

圖3Real-time PCR檢測Caspase3、XBP1、ATF4基因的相對表達量。A：0.1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑；B：1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑；C：10 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml 順鉑。*P<0.05。

3討論

在我們的前期研究中，已發現重樓皂苷能有效抑制腫瘤的生長；因此，在此研究的基礎上，我們提取重樓皂苷中的有效成份，加上有效的化療藥物順鉑處理SKOV3卵巢癌細胞，結果發現這兩種藥物經過適當的配比，能有效地促進腫瘤細胞凋亡，并且其機制是通過內質網應激引起的，為治療卵巢癌提供了新的思路。目前，臨床上應用鉑類和紫杉醇的聯合化療已經明顯改善了卵巢癌的治療效果，尤其近期治療效果，大大提高了患者5年生存率[7]。鉑類是卵巢癌首選的一線化療藥物，其為一種抗癌譜較廣的細胞周期非特異性抗腫瘤藥物；但化療病人還是至少有80%的情況最終會出現耐藥性，最終導致腫瘤治療失敗，腫瘤復發、轉移、擴散，這是制約卵巢癌治愈率提高的非常關鍵的因素，盡管目前二線、三線化療藥物的應用已經取得了一些近期療效，但由于產生的繼發耐藥而使遠期療效并不能令人滿意。因而，提高化療藥物的療效，降低耐藥性，對改善患者預后尤為重要，因而逆轉化療耐藥的研究為所有問題的重中之重，具有重要的理論和實際意義[8]。中藥因其具有良好的生物安全性和廣泛的藥理作用，能夠針對腫瘤耐藥的多因素、多水平發揮作用。研究顯示，中藥調節機體的免疫系統提高免疫力，發揮對機體的保護作用[9]。中藥通過增加Caspase-3基因表達、降低Bcl-2、Survivin基因的表達，使腫瘤細胞的耐藥性下降，誘導細胞凋亡。有研究報道，篩選出多種中藥逆轉劑，能夠明顯增強多藥耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、降低耐藥。研究也顯示其逆轉作用呈劑量、時間依賴關系[10,11]。這些研究結果均和我們的結果一致，我們的實驗結果也顯示中藥重樓皂苷聯合順鉑后可增加Caspase3基因的表達，誘導細胞凋亡。XBP-1和ATF4均是內質網應激反應下游重要的信號因子，其表達增加可間接證明內質網應激反應的發生，本研究從此方面間接證明了重樓皂苷誘導的SKOV3細胞的凋亡是由內質網應激引起的。

參考文獻：

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摘要：目的探討重樓皂苷Ⅶ聯合順鉑誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡的分子機制。方法從中草藥重樓塊根中分離提取重樓皂苷Ⅶ，然后聯合順鉑處理SKOV3細胞，分為以下4組：0.1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml順鉑組、1 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml順鉑組、10 μg/ml重樓皂苷Ⅶ+1 μg/ml順鉑組、對照組。培養24 h和48 h后，MTT法檢測細胞增殖率，Hoechst染色檢測細胞凋亡率，Real-time PCR檢測凋亡相關基因caspase3以及內質網應激相關基因XBP1和ATF4的表達。結果重樓皂苷Ⅶ聯合順鉑能有效促進SKOV3細胞凋亡，其凋亡是通過內質網應激激活caspase途徑引起的。結論重樓皂苷Ⅶ能有效抑制腫瘤細胞生長，為臨床上治療卵巢癌提供了實驗依據。

關鍵詞：卵巢癌；重樓皂苷Ⅶ；順鉑；凋亡；內質網應激

Apoptosis of ovarian cancer cells induced by polyphyllin VII and cisplatin through endoplasmic reticulum stressZHANGJia-ling,ZHENGChang-jun,YANRui-qi,etal.(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of apoptosis of SKOV3 cells induced by polyphyllin VII and cisplatin.MethodsThe polyphyllin VII was extracted from polyphylla root,then used to treat SKOV3 cells combined with cisplatin.The experiments were divided into four groups:0.1 μg/ml polyphyllin VII+1 μg/ml cisplatin group,1 μg/ml polyphyllin VII+1 μg/ml cisplatin group,10 μg/ml polyphyllin VII+1 μg/ml cisplatin group and control group.24 h and 48 h later,the cell proliferation was detected by MTT,cell apoptosis rate was determined by Hoechst staining,and the apoptosis-related gene caspase3 and endoplasmic reticulum stress-related gene XBP1 and ATF4 were detected by real-time PCR.ResultsCombination of polyphyllin VII and cisplatin could be effective in promoting the apoptosis of SKOV3,which was activated through endoplasmic reticulum stress.ConclusionPolyphyllin VII could effectively inhibit the proliferation of tumor cells,which provided an experimental basis for treatment of ovarian cancer in clinic.

Key words:ovarian cancer;polyphyllin VII;cisplatin;apoptosis;endoplasmic reticulum stress

收稿日期：(2014-05-20)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R737.31

文章編號：1007-4287(2015)01-0006-04

通訊作者*

基金項目：中國博士后基金資助(2013M541316)；吉林省衛生廳科研課題(2013Z097);吉林省產業技術研究與開發項目(2013C026-4)