長非編碼RNA的功能研究

姜懷德，李桂林(南昌大學醫學院生理學教研室，江西南昌　330006)

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長非編碼RNA的功能研究

姜懷德，李桂林
(南昌大學醫學院生理學教研室，江西南昌330006)

中國圖書分類號: R-05; R339.38; R342.2; R394; R741

摘要:長非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)是指長度大于200個核苷酸的RNA分子。近年來的研究表明，lncRNAs具有多種重要的生物學功能。隨著現代生物技術的發展，lncRNAs轉錄本的預測及發現已經比較容易，然而不同于蛋白質編碼基因序列所具有的指示功能，lncRNAs序列信息目前不提供功能信息的預測。因此，如何解碼lncRNAs的功能已逐漸成為基因組研究中的熱點問題。我們將對探測lncRNAs功能的研究方法進行綜述。

關鍵詞:長非編碼RNA;衰老;老化相關疾病;轉錄組分析;研究方法;生物信息學

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.003.html

李桂林(1972－)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向:神經生理學和藥理學，通迅作者，Tel: 0791-86360556，E-mail: li.guilin@163.com

人類全基因組測序結果顯示，具有編碼蛋白質功能的基因不到全部基因組序列的2%，而在占據人類基因組98%以上的非蛋白編碼序列中，絕大多數被轉錄成長度大于200個堿基的長非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)。長非編碼RNA是指無蛋白質編碼功能、但往往具有mRNA結構特征(帽式結構和poly A尾巴)的RNA［1］，在對小鼠cDNA文庫的大規模測序研究中被首次發現［2］。近年來，隨著二代測序技術的廣泛應用，長鏈非編碼RNA的神秘面紗才逐漸被揭開，長非編碼RNA是具有多種功能的轉錄本。lncRNA的表達不僅具有細胞或組織特異性，其中某些lncRNA還僅在真核生物發育過程的特定階段產生。越來越多針對長非編碼RNA的功能研究表明，lncRNA可以通過影響mRNA的轉錄、剪接、轉運、穩定性和翻譯等過程，調節蛋白質基因的表達。從而影響劑量補償、基因印跡、細胞周期、端粒生物學、亞細胞結構組成、發育、配子形成及染色體結構動態變化等生物學過程。有的lncRNA轉錄后很快被降解，但同樣具有重要的調節功能;有的lncRNA雖短暫表達，但可以產生長期的調控效應。lncRNAs的異常表達與人類疾病相關，如與老化相關的阿爾茨海默病(AD)和認知障礙、心血管疾病、糖尿病和癌癥等［3］。因此，更好地了解lncRNAs的功能會促進我們對細胞調節和疾病機制的理解。然而由于lncRNAs不具有蛋白質編碼基因序列所具有的指示功能，所以直接對lncRNAs的功能進行研究具有一定的困難。目前對lncRNAs功能的研究主要有lncRNAs表達的高通量分析、高通量數據的驗證和lncRNA-蛋白質相互作用的研究。此外，近年來生物信息技術的快速發展也為lncRNAs功能的研究提供了新的契機。我們將對lncRNA在衰老和老化相關疾病的研究進展及lncRNAs功能的研究方法進行綜述。

1　長非編碼RNA與衰老以及人類老化相關疾病

1.1長非編碼RNA與衰老lncRNAs調節生物體生命周期、組織老化或細胞衰老的研究仍處于起步階段，但lncRNAs作為新興的重要ncRNAs，可能在衰老網絡和衰老相關疾病中發揮作用。lncRNAs參與軸突和樹突聯系的發育和與神經網絡可塑性相關或與學習和記憶相關的長時程增強的突觸調制。在包括老化相關疾病的許多人類疾病中出現多種lncRNAs失調［4］。lncRNA可能作為一種新穎的基于衰老分子機制的代表。然而，關于lncRNAs參與調節細胞衰老復雜過程的信息仍然極少，但隨著轉錄組的持續發展，大量涉及腦老化動態變化的lncRNAs被發現，這表明這些lncRNAs可能在大腦衰老過程中起著非常重要的作用。

在衰老過程中除了lncRNAs的表達模式發生改變，lncRNAs還可能通過直接參與老化網絡在組織老化或細胞衰老水平調節老化。lncRNA ANRIL參與原癌基因誘導衰老的關鍵效應器并在老化期間誘導INK4a、ARF和/或INK4b的抑制。在首次系統研究老化相關的lncRNAs時，研究人員對增殖和衰老的成纖維細胞進行RNA深度測序時發現，許多衰老相關lncRNAs(SAL-RNA)存在差異表達。在這些lncRNAs中，有些SAL-RNAs可調節衰老的發作并保護衰老細胞活力，這表明lncRNAs直接促成衰老表型的形成。此外，有報道稱lncRNA MALAT1在衰老成纖維細胞下調，這與在成纖維細胞中降低MALAT1可啟動細胞衰老的結果相符。這種作用部分歸因于當MALAT1水平較低時B-MYB前體mRNA剪接產生的致癌轉錄因子b-myb/myb12的下調。反過來，b-Myb的水平降低可縮短G2/M細胞周期進程，促進細胞衰老［5］。

lncRNAs可影響參與細胞衰老途徑的調節，在細胞周期進程中起重要作用。細胞衰老的關鍵調節劑p53可以激活具有增殖抑制功能的許多lncRNAs。反之，lncRNAs也可靶向作用于p53和p53途徑分子，從而影響p53的活性。lincRNA-p21作為p53基因的真正下游靶標，細胞凋亡中起作用，同時又反過來作為p53途徑中幾個重要促存活基因的關鍵抑制劑。沉默lincRNA-p21可阻斷程序性細胞死亡(即細胞凋亡)，而不是細胞周期停滯［6］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路在從細胞周期停滯到衰老的轉化過程中起了至關重要的作用。mTOR具有上游調節信號和下游底物兩個不同細胞復合物(mTORC1和mTORC2)的催化亞基。雷帕霉素可阻斷mTORC1激酶，抑制或減速細胞轉化而使細胞保持靜止狀態。抑制mTOR通路可延長包括小鼠在內的模式生物的壽命。Uchl1AS lncRNA也參與mTOR信號通路。其功能是在應激信號通路的控制下由雷帕霉素抑制mTORC1導致UCHL1蛋白增加而實現的。這種蛋白質的突變與早發型家族性帕金森病有關，并在特發性帕金森氏病和AD下調。從上述信息，可以容易地得出結論，lncRNAs在復雜的細胞衰老調控網絡起關鍵作用。

1.2 lncRNAs在老化相關疾病中的作用衰老是生活中不可避免的一部分，不幸的是衰老成了與老化相關的慢性疾病，如AD、認知障礙等疾病發作的最大危險因素［3］(Tab 1)。

AD中BACE1(β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1)反義轉錄物BACE1-AS是人神經系統疾病研究最為透徹的調控關鍵基因的lncRNA。BACE1可使淀粉樣前體蛋白(APP)在腦內異常代謝導致β淀粉樣蛋白(Aβ)在腦內沉積。BACE1 在AD患者腦內的表達高于正常人。BACE1-AS能夠在細胞各種外界壓力刺激條件下，與BACE1 mRNA形成RNA復合物來防止BACE1 mRNA受到核酸酶的降解，從而增加BACE1 mRNA的穩定性，導致更多的Aβ累積，且促進更多BACE1-AS的表達，這個正反饋循環最終加速AD的發展。研究表明使用BACE1-AS siRNA降低BACE1-AS的表達水平后，BACE1 mRNA與Aβ的表達水平也同時下降，這就表明BACE1-AS是一個較理想的治療AD的藥物靶點［7］。

腦胞質(BC)RNA是AD和腦老化的另一種lncRNA。小鼠BC1 RNA和人的BCYRN1/BC200 RNA是將核蛋白顆粒轉運到樹突的lncRNA轉錄本，可在翻譯水平調節基因表達。AD患者Brodmann 9區(受AD影響的主要腦區)的BCYRN1/BC200水平較相同年齡的正常人持續升高，且該腦區的BCYRN1/BC200水平與AD嚴重程度呈正相關［8］。BCYRN1/BC200 RNA與一些涉及mRNA異常轉運的RNA結合蛋白相互作用，例如翻譯起始調節因子poly(A)結合蛋白(PABP1)，與神經元和少突膠質細胞的mRNA轉運有關的hnRNPA2和突觸結合胞質RNA相互作用蛋白(synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA interacting protein，SYNCRIP)，SYNCRIP是mRNA轉運顆粒的一部分，可能參與神經元突觸后位點局部定位蛋白質的合成。所有的這些似乎都證明了BCYRN1/BC200在樹突局部蛋白質合成中具有調節作用，AD和腦老化時CYRN1/BC200的過表達可能引起突觸樹突退化。此外，位于突觸區域的BC1可能具有BCYRN1/BC200 lncRNA類似的功能，它與翻譯支架復合體中的關鍵蛋白相互作用并且通過調節決定突觸功能的突觸蛋白質的合成維持長時程突觸可塑性。BC1 lncRNA通過抑制與多巴胺D2受體產生相互作用并下調D2受體的突觸蛋白負向調節紋狀體多巴胺D2受體介導的突觸傳遞。將BC1－/－小鼠關在籠子里飼養時不表現明顯的表型或者神經異常，但是當將其放養時，BC1－/－小鼠表現出異常認知和異常行為表型，更容易焦慮，成活率降低。

Tab 1　lncRNAs are implicated in Alzheimer’s and cognitive disorder

除了AD，lncRNAs還與認知和行為障礙有關。例如主要表達在新皮層發育期Cajal-Retzius細胞的高加速區1(HAR1)。HAR1控制徑向遷移和皮質板錐體神經元的層定位。HAR1與涉及正常認知功能和多種認知障礙(例如，神經元遷移缺陷、自閉癥、精神分裂癥、雙相性精神障礙、癲癇癥、中風和AD)的reelin共表達。亨廷頓病(HD)患者紋狀體中HAR1的表達降低。此外FMR1反義RNA1(FMR4/ASFMR1)與脆性X綜合征(FXS，自閉癥的常見原因)有關。

lncRNAs也與印跡疾病有關，例如天使綜合征(angelman syndrome，AS)患者的泛素蛋白連接酶E3A(UBE3A)-ATS。天使綜合癥由母系單基因遺傳缺陷所致。UBE3A缺乏導致這種印跡相關的神經發育障礙。UBE3A在大多數組織中呈雙等位基因表達，但只有母系等位基因UBE3A在大腦中表達。天使綜合征患者母系UBE3A基因缺失或失活，導致神經細胞UBE3A功能性喪失，反義lncRNA轉錄物UBE3AATS可調節表觀遺傳沉默的父系等位基因，使體內沉睡的父系UBE3A基因重新開始活躍，從而增加父系UBE3A在大腦的表達，讓它能夠指導合成大腦發育所需的正確蛋白質，而為天使綜合征提供新的治療方案［9］。

神經內分泌蛋白反義(NESPAS)lncRNA來源于基因座，調節在藍斑－去甲腎上腺素系統中明顯表達的神經內分泌蛋白55(NESP55)。藍斑－去甲腎上腺素系統是狀態依賴性神經網絡活動的重要調質，并與神經退行性疾病和神經障礙相關。此外，腦老化及相關認知表型與lncRNA介導的突觸和神經網絡連通性、可塑性和應激反應的改變有關。lncRNA HSR1，在促進細胞保護的熱休克反應中起重要作用，并與神經發育、腦老化和各種神經退行性疾病的分子發病機制有關。

總之，中樞神經系統中的轉錄境況特別復雜，因為mRNAs和lncRNAs都受神經元活動調控，這種錯綜復雜的調控網絡的中斷可能會導致正常的大腦發育和功能的破壞。研究lncRNA的行為機制無疑將為神經障礙的分子基礎提供有價值的見解，這可能會產生新的治療和診斷方法。

2　lncRNAs表達的高通量分析

2.1芯片基因芯片的發展對于實現基因的大量分析而言是一種飛躍式的進步，它們對于全基因組基因表達分析的巨大容量使得其成為發現靶標的理想工具，從而使我們能夠快速地評估不同組織或不同細胞類型中轉錄譜間的差異。隨著越來越多的lncRNA被發現，專門針對lncRNA的芯片也被設計開發出來，如晶芯人類長非編碼RNA表達譜芯片和Arraystar lncRNA芯片等同時針對mRNA和lncRNA進行大規模檢測，發現差異表達的lncRNA和mRNA，并挖掘二者之間的關聯。Arraystar lncRNA芯片檢測支氣管上皮囊性纖維化患者和非囊性纖維化人群發現在30 586個lncRNA中有差異表達的有1 063個，在26 109個編碼蛋白的基因中720個有差異表達，經GO生物信息學分析顯示囊性纖維化主要與炎癥相關。研究結果還提示lncRNA失調在囊性纖維化患者肺部慢性感染和炎癥中起著重要的作用［10］。

Φrom等用芯片對人成纖維細胞、角質細胞和HeLa細胞進行lncRNAs轉錄譜分析時檢測到了一千多種lncRNAs。Dinger等采用了專門設計的芯片來檢查小鼠胚胎干細胞分化期間其胚胎干細胞的表達圖譜，確定在分化期間表達的lncRNAs有945個，其中174個差異性表達并與全能性或特定事件的分化相關聯。Pang等發現CD8+T細胞表達數百種lncRNAs，其中有許多是淋巴特異性的和/或隨淋巴細胞分化或活化動態地改變。Mercer等通過芯片平臺揭示了lncRNAs在神經元和少突膠質細胞譜系特異性、神經元－膠質細胞命運轉換，以及少突膠質細胞包括髓鞘形成在內的進展期的動態表達模式。

2.2轉錄組分析轉錄組(RNA-seq)是指細胞在特定發育階段或生理狀態下所有轉錄本的集合，包括mRNA、非編碼RNA和小分子RNA。與傳統的芯片雜交相比，RNA-Seq具有定量更準確、可重復性更高、檢測范圍更廣、分析更可靠等特點，能夠對任何物種進行全基因組水平的基因表達差異研究，可以檢出低豐度轉錄本。除了分析基因表達水平，RNASeq還能發現新的轉錄本、SNP、剪接變體，并提供等位基因特異的基因表達。

Soreq等［11］利用RNA-seq技術和一種用于深度探索全基因組RNA-seq數據集的新穎計算流程檢測并分析了帕金森病患者治療前后白細胞的lncRNAs，他們新發現了7 000多個lncRNAs，大大豐富了目前可利用而又為數不多的人組織來源的lncRNAs數據庫。Pauli等按時間順序在斑馬魚早期發育的八個階段進行了轉錄組測序，確定了在胚胎發育過程中由多外顯子轉錄所產生的1 133個非編碼轉錄本。為識別轉移性黑色素瘤中差異性表達基因和單核苷酸變異，Liu等［12］使用RNA-seq技術對兩個正常樣本和兩個轉移性黑色素瘤樣本進行了轉錄組測序，他們確定了18個顯著的差異性表達基因和33 096個單核苷酸變異。Lin等對iPS細胞來源的人類神經元進行轉錄組分析結果顯示lncRNAs參與了神經的發生和神經功能障礙。另外，在RNA-seq測序數據的幫助下，Rackham等發現線粒體基因組產生的lncRNAs受核基因編碼的蛋白質的調控。

3　高通量數據的驗證

盡管芯片和RNA-seq是發現靶標非常好的工具，然而待測靶標的驗證還有賴于其它分子生物學方法的幫助。Northern blots、實時定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)、熒光原位雜交(FISH)、RNA干擾(RNAi)是用來進行高通量數據驗證相對比較成熟的方法。

3.1 Northern blots和Q-PCR Northern blots可以直接檢測RNA轉錄本的存在和不同發育階段、不同環境和不同治療階段組織和細胞RNA的表達模式。實時定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)是一種擴增并同時量化目標分子的實驗室技術，Q-PCR可以結合逆轉錄定量細胞或組織中的信使RNA和非編碼RNA。Furuno等運用Northern blots和Q-PCR證實了已知蛋白編碼基因以外的8個新lncRNAs的存在。Perez等應用Northern blots證明了lncRNAs轉錄本的長度與癌癥發病有關。Q-PCR方法可精確定量不同人體組織及乳腺癌和卵巢癌中每個非編碼RNA的表達。

3.2熒光原位雜交(FISH)FISH是用來檢測和定位組織樣本中特定RNA轉錄物的一種細胞遺傳學技術，它可以幫助定義細胞和組織中基因表達的時空模式。RNA熒光原位雜交(RNA-FISH)是研究lncRNAs的分布和功能的重要工具［13］。研究者們已經運用該技術檢測并定位了許多lncRNAs，例如Xist、MALAT1、MEN ε/β、Kcnq1ot1和HA117等。為了揭示在X染色體失活中的作用，Chureau等運用RNAFISH技術分析了FTX在雌性胚胎干細胞分化過程中的表達。Tripathi等運用RNA-FISH技術分析MALAT1的位置結果表明MALAT1富集在間期細胞核內。Sasaki等通過RNAFISH揭示了MENε/β信號定位于離散斑點，表示核小體存在于所有細胞系中。此外，Redrup等應用RNA-FISH技術于E12.5胎盤切片中檢測KCNQ1、Kcnq1ot1和Xist。進一步實驗結果表明，Kcnq1ot1形成了一個區域，若基因位于該區域內部則有可能使表觀遺傳失活，而基因位于該區域外則沒有這種現象。Liu等［14］用FISH檢測先天性巨結腸癥患者結腸時發現長非編碼RNA HA117主要分布在狹窄段的腸粘膜和肌層。

3.3 RNA干擾(RNAi)自從AndrewFire等揭示了RNA具有干擾基因表達的機制自今，RNAi技術在生物學領域得到了長足的發展，尤其是在lncRNAs的研究領域方面。這與其自身的優點是密切相關的，RNAi對基因表達的選擇性以及其dsRNA的穩定性，使RNAi技術較反義RNA技術具有一定的優勢。

研究發現采用RNAi技術降低非編碼RNA的表達可導致其鄰近的蛋白質編碼基因表達下降，表明lncRNAs在人類細胞系中起增強子的作用。HOTAIR是一個模塊化的雙功能RNA，對復合物中核心蛋白復合體2(PRC2)和LSD1具有不同的結合結構域。用小干擾RNA沉默HOTAIR可以解除PRC2和LSD1之間的相互作用，這表明HOTAIR可能在PRC2和LSD1之間充當支架作用。用shRNA敲低gadd7可以明顯降低脂質和非脂質誘導的活性氧，還可以明顯地推遲和削弱活性氧引起的內質網應激反應，這表明非編碼RNA gadd7可能是內質網應激反應的調節因子。此外，在白血病NB4細胞髓樣分化期間，敲低HOTAIRM1可降低RA誘導的HOXA1和HOXA4的表達，并選擇性地降低髓樣分化基因ITGAM和ITGB218的轉錄誘導，說明HOTAIRM1通過調控基因表達在髓細胞生成過程中起著一定作用。

4　lncRNA-蛋白質相互作用的研究方法

越來越多的研究表明，lncRNAs以RNA－蛋白質復合物的形式起調控作用，例如染色質修飾復合物、轉錄因子復合物、核糖核蛋白復合物等。因此，對lncRNAs和蛋白質相互作用加以研究有助于揭開lncRNAs生物學過程的機制。

4.1 RNA免疫沉淀(RIP)在研究活細胞或組織中蛋白質和RNA之間的相互作用時，RNA免疫沉積(RNA-immunoprecipatation，RIP)是一種非常有價值的實驗技術。該技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白質復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。Pandey等用RIP技術揭示Kcnq1ot1與H3K9甲基轉移酶和PRC2間的相互作用。Rinn等借助hnRNP-K的抗體，運用RIP技術證實了在MEF細胞核抽提物中，lincRNA-p21和hnRNP-K之間存在相互作用，lincRNA-p21通過hnRNP-K調節p53介導的細胞凋亡［6］。此外，Zhao等用RIP技術揭示了RepA、Xist和Tsix都是與PRC2存在相互作用的非編碼RNA。

4.2 RIP-Chip和RIP-Seq RIP-Chip和RIP-Seq是RIP分別與Chip和RNA-seq結合所形成的衍生技術，目前這兩種技術都已被廣泛地應用于尋找RNA和蛋白的相互作用中。Khalil等用RIP-Chip技術發現有大量的lncRNAs與染色質修飾復合物有關聯并且影響基因的表達，其中PRC2在干細胞更新和人類疾病中發揮重要作用。在小鼠胚胎干細胞中，Mohamed等用RIP-Chip技術揭示了一些保守lncRNAs轉錄由POU5F1和NANOG調控，Nanog可能調節干細胞多能性。Zhao等使用RIP-Chip和RIP-Seq方法捕獲胚胎干細胞中PRC2的轉錄組，并確定了9000多個與PRC2相互作用的RNA轉錄本。

4.3 CLIP和c-KLAN交聯－免疫沉淀法(crosslinkingimmunopurification，CLIP)為活體實驗中探測RNA與蛋白間的相互作用提供了一種突破性的研究策略。該法的主要過程是用紫外線照射組織或細胞，當細胞中RNA和RNA結合蛋白之間近距離接觸時便可形成共價鍵。紫外交聯后用免疫共沉淀的試驗方法對RNA及RNA結合蛋白(RBPs)進行分離純化，RNA隨即被轉換成cDNA文庫，并且使用Solexa技術進行深入測序，與lncRNA結合的蛋白可通過SDS-PAGE分離染色后進行質譜鑒定或直接通過液質聯用的方法進行蛋白質鑒定。Ule等首次采用CLIP技術證實了NOVA依賴性的剪接調控功能。如今以CLIP技術為基礎已經衍生出了高通量測序交聯－免疫沉淀技術(HITS-CLIP)、光活性增強的核糖核苷交聯和免疫共沉淀技術(PAR-CLIP)、單核苷酸分辨率交聯－免疫沉淀技術(iCLIP)。

非編碼RNA沉默與定位分析技術(combined knockdown and localization analysis of non-coding RNAs，c-KLAN)是一種近年來發現的研究lncRNAs功能及其細胞定位非常有價值的技術，該技術針對目的lncRNA設計引物，將其逆轉錄成cDNA，PCR擴增cDNA。一方面對擴增產物進行體外轉錄生成dsRNA，用核糖核酸內切酶Ⅲ酶切dsRNA來制備esiRNA(endoribonuclease-prepared siRNA)，用于對lncRNA進行功能缺失研究;另一方面用熒光標記的UTP對擴增產物進行體外轉錄，以制備lncRNAs正義或反義的FISH探針從而達到對特定組織或細胞中靶lncRNAs進行定位的目的。Chakraborty等運用c-KLAN技術確定了多能性相關非編碼轉錄物1(pluripotency-associated noncoding transcript 1，Panct1)主要位于胚胎干細胞的細胞核中，同時進一步研究發現Panct1在維持胚胎干細胞的多能性方面起著決定性作用。

4.4 ChIRP-seq ChIRP-seq是以RNA純化的染色質分離(chromatin isolation by RNA purification，ChIRP)技術為基礎，經進一步改造而形成的，是一種檢測與RNA結合的DNA和蛋白質的高通量測序方法。該法的基本原理是基于生物素和鏈霉親和素之間、寡核苷酸探針與lncRNAs之間的相互作用，生物素化的寡核苷酸探針與lncRNAs雜交后可以被結合有鏈霉親和素的磁珠拉下來，這樣與lncRNAs結合的染色質復合體也被拉下來，最后把染色體片段做高通量測序，以確定該lncRNA能夠結合到基因組的哪些區域。Quinn等運用ChIRP-seq技術確定了3個lncRNAs(drosophila roX2、human TERC和HOTAIR)在基因組上的定位，這些lncRNAs的結合位點具有序列特異性或區域特異性。例如，roX2主要定位于X染色體上，并且趨向定位于每個基因的3＇端; TERC主要富集于端粒DNA和Wnt受體信號通路基因上; HOTAIR lncRNA優先定位于富含GA的DNA區域。

最近，Chang等對ChIRP進行了改造，發布了稱為dChIRP(domain－specific ChIRP)的新技術。該技術可以在天然環境下剖析lncRNAs不同結構域的功能，這無疑將為研究lncRNAs功能提供了又一個實用的工具。他們首先設計了生物素化的反義寡核苷酸池來靶標lncRNAs的特定結構域。隨后通過交聯保護了細胞中的lncRNAs互作，并利用超聲處理使lncRNAs形成結構域大小的片段。最后通過鏈霉親和素磁珠，將lncRNAs結構域連同它的互作搭檔一起純化出來，并對這些純化產物進行分析(WB、逆轉錄定量PCR、定量PCR或者測序)，從而鑒定了RNA-蛋白、RNA-RNA和RNA-染色質間的互作。通過dChIRP技術他們對一種稱為roX1的雄性果蠅劑量補償效應所需的lncRNAs進行研究，并揭示了roX1功能域的組成結構，向人們展示了由3個不同結構域組成的3指手掌結構，其中的3個指狀結構域負責與染色質互作，是功能獨立的RNA亞單位［15］。

5　生物信息學

與耗時且昂貴的傳統實驗方法相比，用生物信息學技術對lncRNAs的功能進行計算預測正逐漸得到研究人員的青睞。例如，Tartaglia等開發的catRAPID在線算法，該算法可以通過對所要研究的蛋白和RNA的序列分析來預測它們之間可能存在的相互作用，其基本原理是基于RNA和蛋白質的二級結構、氫鍵和分子間作用力。據Tartaglia介紹，該算法可在10 min內完成輸入序列與整個轉錄組(或蛋白質組)的比對分析，這大大節約了實驗時間與實驗成本。其網址為http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group。Liao等已經利用catRAPID算法預測了約340個lncRNAs的功能，主要涉及器官或組織的生成，細胞轉運或代謝過程等方面。

在lncRNAs的功能研究中，建立相關的lncRNAs數據庫并對lncRNAs進行功能注釋是非常有必要的，這使得研究人員知道要尋找什么，并讓他們知道如何對他們新發現的東西進行命名，從而方便其他研究人員對lncRNAs進行研究。為了便于研究和學術交流，相關研究人員已經建立了多個在線1ncRNA數據庫(Tab 2)。這些數據庫所收錄的1ncRNA數據來自已發表的論文和GenBank。

Tab 2　Publicly available lncRNA online databases

6　展望

近年來對lncRNAs的研究呈現出一種井噴模式，然而與已發現的lncRNAs的數量相比，目前對lncRNAs功能研究所取得的成果依舊很少，其主要原因如下:首先，lncRNAs物種之間保守性不高，這使得不同生物之間進行lncRNAs功能比對更加困難，同時也導致了一個給定的lncRNAs功能的不確定性。其次，lncRNAs數據庫還不充足，lncRNAs功能預測工具還很少，以及lncRNAs功能研究的實驗技術還不完善等原因都對lncRNAs的功能研究有一定的限制。

但是我們必須認識到，lncRNAs的功能研究尚處于起步階段，就lncRNAs的研究正逐漸成為基因組研究的又一個熱點以及當前生物信息技術的快速發展而言，我們相信更多的科研人員將投身于lncRNAs的功能研究中，更多更有效的研究工具將如雨后春筍般層出不窮，這必將有助于我們進一步解析lncRNAs的功能及其分子調控機制，最終揭開lncRNAs的神秘面紗。

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On function of long noncoding RNA

JIANG Huai-de，LI Gui-lin
(Dept of Physiology，Basic Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China)

Abstract:Long noncoding RNAs(lncRNAs)are transcribed RNA molecules greater than 200 nucleotides in length.In recent years，studies have shown that lncRNAs have many important biological functions.With the development of modern biological technology，lncRNAs transcripts can be easily detected and predicted.However，unlike protein-coding genes whose sequence motifs usually have indicative function，lncRNA sequence information is currently uninformative for function prediction.Thus，how to decode the function of lncRNAs has gradually become a hot issue in genome research.The paper summarizes the studies regarding the methods to probe the function of lncRNAs.

Key words:long noncoding RNA; aging; diseases related to aging; transcriptome analysis; the research methods; bioinformatics

作者簡介:姜懷德(1990－)，男，碩士生，研究方向:神經生理學和藥理學，E-mail: jianghd1101@126.com;

基金項目:國家自然科學基金資助課題(No 81200853，81171184，31060139)

收稿日期:2015－03－25，修回日期:2015－04－23

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0900－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.003