沉默Piwil2表達對子宮頸癌細胞增殖和衰老的影響

張紅麗，馮定慶，凌 斌，3，尤青葉，李 兵，伍嬌嬌，趙婷婷

沉默Piwil2表達對子宮頸癌細胞增殖和衰老的影響

張紅麗1，馮定慶2，凌 斌1，3，尤青葉1，李 兵1，伍嬌嬌1，趙婷婷1

摘要目的 采用shRNA沉默Piwil2基因的表達，探討其對宮頸癌細胞株增殖和衰老特性的影響。方法 通過脂質體Lipofectamine2000轉染技術和嘌呤霉素篩選，建立穩轉Sh-piwil2宮頸癌細胞株，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和Western blot法驗證沉默效果。采用細胞增殖實驗、集落形成實驗、細胞周期和細胞衰老等實驗觀察沉默Piwil2表達對宮頸癌細胞生物學特性的影響。結果建立穩定轉染Sh-piwil2宮頸癌細胞株，與對照組相比，沉默Piwil2表達后細胞的增殖和集落形成能力均顯著降低（P＜0.05）；細胞G0／G1期比例增加、S期比例明顯下降（P＜0.05），同時沉默Piwil2后細胞衰老數量明顯增多（P＜0.05）。結論 沉默Piwil2基因可發揮抗宮頸癌作用，推測Piwil2基因可作為宮頸癌臨床治療的一個潛在靶點。

關鍵詞宮頸癌；shRNA；Piwil2；細胞增殖；細胞衰老

2015-01-12接收

3衛生部中日友好醫院婦產科，北京 100086

宮頸癌是女性生殖系統第一位惡性腫瘤，目前手術與化療是主要的治療手段，但并發癥、副作用等使治療具有局限性，迫切需要一種更為有效的方法來達到治愈宮頸癌的目的［1］。研究［2］證實腫瘤干細胞是腫瘤發生、轉移和復發的根源，因此尋找一種特異性表達在腫瘤干細胞中的基因作為靶點會為宮頸癌的治療帶來突破。Piwil2蛋白是AGO／PIWI蛋白家族的一種，正常情況下只表達在睪丸組織中，另外也可特異性表達在腫瘤細胞和腫瘤干細胞中，賦予腫瘤干細胞惡性轉化能力［3］。課題組前期研究［4］也證實Piwil2可作為宮頸癌干細胞的特異標志物之一。該研究運用shRNA沉默宮頸癌細胞株中Piwil2基因的表達，觀察對細胞增殖和衰老等特性的影響，為探討Piwil2基因作為宮頸癌治療靶點提供基礎依據。

1　材料與方法

1.1 細胞和試劑 人宮頸癌C33A和Hela細胞由安徽醫科大學附屬省立醫院分子醫學重點實驗室保存；實驗所需質粒pGFP-VRS shRNA-piwil2由美國Origene公司構建和合成；質粒小量提取試劑盒購自美國Axygen公司；RNA提取試劑TRIzol、DNA轉染試劑Lipofectamine2000、DMEM細胞培養液、胎牛血清購自美國Invitrogene公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒的擴增與提取 將購買的ShRNA-piwil2質粒轉化BL21感受態大腸桿菌，42℃熱擊、冰浴、搖床、涂板、37℃培養16 h，挑選卡那霉素陽性菌落，搖菌，菌種于-20℃保存。參照Takara Min-BEST質粒小量提取試劑盒操作規程提取純化質粒。

1.2.2 穩定表達Sh-piwil2宮頸癌細胞系的建立將宮頸癌C33A和Hela細胞以2×105個／孔接種于6孔板上，當細胞融合達到60%～70%時，采用Lipofectamine2000進行Sh-piwil2質粒轉染，轉染6 h

后更換完全培養基。嘌呤霉素持續壓力篩選出陽性細胞克隆，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達情況。

1.2.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測Piwil2 mRNA的表達水平 取對數生長期的宮頸癌細胞，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細胞總RNA，再反轉錄成cDNA，穩定保存。采用qRT-PCR檢測Piwil2 mRNA的相對表達水平。Piwil2基因上、下游引物序列分別為5′-GTGCCAGAAACCGTTGAATC-3′、5′-TTGTGTTTCTGTGCGTCGTT-3′，擴增產物大小為102 bp；內參GAPDH基因的上、下游引物序列分別為5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′，擴增產物大小為99 bp。

1.2.4 Western blot法檢測Piwil2蛋白的表達水平

在館藏圖書流通實踐中，流通部門通常關注預約頻次超過2次的圖書類別。表1顯示，O類、P類和Q類圖書應引起流通部門的注意。根據預約率與預約頻次兩個指標，流通部門通常認定預約率大于0.5%并且預約頻次大于2次即為需要提高復本數量的圖書類別。因此，本館的流通部門有必要通知采編部門在以后的圖書采購中注意增加O類和Q類圖書的復本數量。這也符合《黑龍江東方學院圖書館文獻采訪條例》第九條規定：重點搜集本院特色專業“生物工程”“食品科學與工程”和“高分子材料與工程”以及理工類基礎課“數學”“物理”和“化學”等教學和科研所需的各種類型文獻。

收集細胞，將細胞裂解后提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，加入SDS煮沸變性，取60 μg蛋白上樣，經10%SDS-PAGE膠110 V恒壓電泳1.5 h分離，200 mA恒流轉膜30 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入兔抗人Piwil2抗體（稀釋度1∶800）和兔抗人GAPDH抗體（稀釋度1∶2 000），4℃孵育過夜，TBS-T洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育2 h，TBS-T洗膜，暗室壓片顯影。

1.2.5 CellTiter96AQueous細胞增殖法檢測宮頸癌細胞增殖情況 將對數生長期的細胞以1×104個／孔接種于96孔板中，分別于24、48、72、96 h加入CellTiter96Aqueous單溶液40 μl，37℃避光孵育2 h，于酶標儀490 nm波長處檢測吸光度值（optical density，OD490）。

1.2.6 細胞集落形成實驗 取對數生長期細胞，制成單細胞懸液，按每孔500個細胞接種于6孔板內，37℃、5%CO2培養箱培養，每隔3 d換1次液，3個星期后終止培養，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，拍照，顯微鏡下計算超過50個細胞的克隆數。

1.2.7 流式細胞儀檢測宮頸癌細胞周期的變化細胞離心棄上清液后，緩慢加入預冷的70%乙醇溶液，-20℃固定過夜，次日離心棄乙醇，PBS水化15 min，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，室溫孵育30 min后上機檢測。

1.2.8 β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老 收集兩組細胞離心后重懸，以1×106個／孔接種于6孔板中，貼壁24 h后用細胞衰老試劑盒染色，顯微鏡下觀察細胞衰老情況并計數其比例。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，模塊分析用t檢驗，數值均以±s表示，每組實驗重復3次。

2　結果

2.1 shRNA穩轉C33A和Hela細胞對Piwil2表達的影響 轉染shRNA的細胞可見綠色熒光，見圖1；qRT-PCR和Western blot法顯示，沉默Piwil2組與對照組相比，其Piwil2 mRNA和蛋白表達水平均降低（t＝9.526、1.628，P＜0.05），見圖2。以上實驗證明成功建立穩定轉染Sh-piwil2宮頸癌細胞株。

2.2 沉默Piwil2表達抑制C33A和Hela細胞增殖能力 細胞增殖實驗顯示，分別從72 h和48 h開始，沉默Piwil2組細胞增殖均較對照組緩慢，差異均有統計學意義（t＝6.943、5.167，P＜0.05），見圖3。集落形成實驗的結果表明，沉默Piwil2組的C33A 和Hela細胞的每孔集落形成數分別為（64.67± 5.86）個／孔、（88.87±6.62）個／孔，較對照組（327.67±16.56）個／孔、（399.01±16.09）個／孔有明顯減少，差異均有統計學意義（t＝25.93、29.44，P ＜0.05），見圖4。實驗表明與對照組相比，沉默Piwil2組細胞的增殖能力下降。

2.3 沉默Piwil2的表達對宮頸癌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組比較，沉默Piwil2組C33A和Hela細胞的G0／G1期比例增加（t ＝10.90、11.36，P＜0.01），S期比例減少（t＝16.15、28.59，P＜0.01），G2／M變化不明顯，見表1。證明沉默Piwil2的表達可使細胞發生周期阻滯，從而抑制細胞增殖。

表1　細胞周期實驗統計學結果

2.4 沉默Piwil2基因促進宮頸癌細胞衰老 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老情況，結果顯示沉默Piwil2組表達的C33A和Hela細胞其細胞衰老程度［（49.02±2.01）%、（41.33±5.87）%］均較對照組［（24.67±3.51）%、（14.67±2.52）%］增加，差異有統計學意義（t＝10.43、7.428，P＜0.05），表明沉默Piwil2基因表達可以抑制細胞的增殖，使細胞衰老數增加，見圖5。

3　討論

Piwil2基因位于人的第8號染色體和鼠的第14號染色體上，可表達于不同種屬睪丸組織的生殖干細胞中，而在其他正常組織中很少表達。Piwil2蛋白分子量為110 ku左右，屬于一種進化高度保守的堿性蛋白，包括PAZ和PIWI兩種結構域，可與長度為25～31nt的Piwi相關RNA相互作用結合，通過DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾機制介導轉座子基因沉默，保護生殖干細胞基因組的穩定性和完整性，對生殖干細胞的自我更新、配子和胚胎的發育具有重要的作用［5-6］。由于Piwil2基因可特異性的表達在腫瘤干細胞和腫瘤前體細胞中，因此其可能與小RNA相互作用，從而在腫瘤的表觀遺傳學修飾中發揮重要作用。研究［7］顯示Piwil2表達增加和DNA高甲基化呈正相關，導致相應抑癌基因如細胞色素依賴激酶的表達沉默，而用DNA甲基化酶抑制劑可減少腫瘤整體的甲基化水平而抑制腫瘤的增殖。另外Piwil2表達增加可以上調Stat3和Bcl基因表達，抑制p53蛋白的表達，同時Piwil2可以和NF-κB共同表達在細胞核中，使細胞從G0／M期進入S期，促進腫瘤惡性增殖，而抑制Piwil2表達可恢復p53的水平使腫瘤細胞的G2／M期細胞減少，使腫瘤增殖抑制［8］。p53與NF-κB信號通路通常與細胞衰老途徑等密切相關，這些都說明Piwil2基因作為一種癌基因在促進腫瘤增殖中具有重要的作用，但其具體作用機制還有待于進一步的研究和論證。

為了研究Piwil2基因在宮頸癌中的具體作用，本實驗運用shRNA轉染宮頸癌細胞特異性沉默Piwil2基因的表達，觀察細胞生物學特性的變化。結果顯示轉染shRNA后Piwil2的表達水平明顯降低，說明建立穩定轉染Sh-piwil2的宮頸癌細胞。細胞增殖實驗表明沉默Piwil2組細胞的增殖能力較對照組明顯下降，其中C33A細胞在72 h可發生明顯的增殖抑制，而Hela細胞在48 h即可發生明顯的抑制，這可能與兩組細胞轉染沉默的效率不同有關；集落形成實驗亦顯示沉默Piwil2后兩組宮頸癌細胞的集落形成數均較對照組明顯減少，表明抑制Piwil2表達可以抑制宮頸癌細胞的增殖。用流式細胞儀檢測分析細胞周期的變化，可以看出兩組Sh-piwil2宮頸癌細胞的G0／G1期比例明顯上升，S期的比例減少，而G2／M則變化不明顯，從而進一步證明沉默Piwil2可以使細胞周期阻滯在G0／G1期，繼之細胞衰老實驗證明沉默Piwil2組細胞的衰老數增多，表明沉默Piwil2基因可以抑制細胞的增殖，從而導致

細胞的衰老，使宮頸癌細胞惡性生物學行為發生一定程度的逆轉。

綜上所述，本研究證實Piwil2基因在宮頸癌發生發展中具有重要作用，運用shRNA可以特異性沉默Piwil2的表達，從而抑制細胞的增殖，使細胞衰老增多。這與前期實驗研究［9］顯示Piwil2基因過表達可以導致細胞生物學行為發生惡性轉化的結論相符合，并且進一步證明Piwil2表達增加與腫瘤細胞衰老呈負相關。另外抑制Piwil2蛋白表達可以抑制腫瘤的侵襲和轉移，并且可以增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性［10-11］，由此推測Piwil2基因有可能作為宮頸癌臨床治療的一個潛在作用靶點，這為后續的基礎研究和進一步臨床治療研究提供了理論依據。

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Silencing of Piwil2 expression on the proliferation and senescence of cervical cancer cells

Zhang Hongli1，Feng Dingqing2，Ling Bin1，3，et al
（1Dept of Obstetrics and Gynecology，2Molecular Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；3Dept of Obstetrics and Gynecology，China-Japan Friendship Hospital，Bejing 100086）

AbstractObjective To explore the effect of silencing Piwil2 gene by shRNA on the proliferation and senescence of cervical cancer cells.Methods Constructed the stable Sh-piwil2 cervical cancer cells via Lipofectamine2000 mediation and puromycin selection.The efficiency of transfection was confirmed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）and Western blot.Cell proliferation assay，colony forming assay，cell cycle assay and cell senescence assay were detected the influence of silencing Piwil2 gene on the biological behavior of cervical cancer cells.Results The stable Sh-piwil2 cervical cancer cells were constructed.Compared with the Vector groups，the growth and colony forming rate were significantly decreased.Moreover，the cell cycle was arrested in the G0／G1 phase and the cell senescence was increased through silence the expression of Piwil2 gene.Conclusion Silencing Piwil2 gene can effectively suppress cell proliferation of cervical cancer cells.We speculate that Piwil2 gene may become a potential target in clinical therapy for cervical cancer.

Key wordscervical cancer；shRNA；Piwil2；cell proliferation；cell senescence

作者簡介：張紅麗，女，碩士研究生；凌 斌，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：lingbin.ling＠gmail.com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81372777、81372779、81072127）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0589-05

中圖分類號R 737.33