丹參多酚對鐵過載引起的臍血造血細胞氧化應激損傷的抑制作用

穆娟，趙明峰，李玉明，張宇辰，曹小立，李青(1 天津醫科大學一中心臨床學院，天津300070；天津市第一中心醫院)

·論著·

丹參多酚對鐵過載引起的臍血造血細胞氧化應激損傷的抑制作用

穆娟1,2，趙明峰2，李玉明2，張宇辰2，曹小立2，李青2(1 天津醫科大學一中心臨床學院，天津300070；2天津市第一中心醫院)

摘要：目的探討丹參多酚對鐵過載引起的臍血造血細胞氧化應激損傷的保護作用。方法 分離臍血單個核細胞，分為對照組、模型組、丹參多酚低、中、高劑量組。模型組及丹參多酚低、中、高劑量組以400 μmol/L濃度的枸櫞酸鐵胺(FAC)建立鐵過載細胞模型，丹參多酚低、中、高劑量組于培養第3天分別加入18、50、160 μg/mL丹參多酚培養24 h;對照組不加FAC及丹參多酚。采用流式細胞術檢測各組細胞的活性氧(ROS)水平、細胞凋亡率，計數各組細胞集落形成數量。結果模型組ROS水平高于對照組及丹參多酚各劑量組(P均<0.05)。模型組細胞凋亡率高于對照組及丹參多酚高劑量組(P<0.05)。模型組紅系祖細胞集落形成單位(CFU-E)、?！獑魏讼底婕毎湫纬蓡挝?CFU-GM)、爆式紅系祖細胞集落形成單位(BFU-E)和混合祖細胞集落形成單位(CFU-mix)數量均低于對照組及丹參多酚高劑量組(P均<0.05)。結論丹參多酚可減輕氧化應激引起的細胞凋亡及其對造血細胞增殖、分化功能的抑制作用。

關鍵詞：丹參多酚；鐵過載；氧化應激；細胞凋亡；造血干細胞；血液病

研究發現，鐵過載可通過介導干祖細胞內活性氧(ROS)水平升高而抑制骨髓造血功能[1,2]。再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、骨髓纖維化等血液系統疾病均可導致造血細胞內鐵過載現象，主要由于長期貧血反復大量輸血或原發病引起。丹參是一種活血化瘀中藥，研究發現，丹參可通過抑制細胞內ROS從而抑制細胞凋亡，保護機體不受氧化損傷。丹參多酚是丹參的提取物。2013～2014年，我們將丹參多酚作用于鐵過載的臍帶血造血細胞，觀察其對鐵過載引起的細胞過氧化應激反應的抑制作用，探討丹參多酚對造血細胞的保護作用。

1材料與方法

1.1材料與試劑新鮮臍帶血來自本院產科健康足月分娩產婦，征得產婦及家屬知情同意。丹參多酚酸鹽購自上海綠谷制藥有限公司，RPMI 1640培養液購自Gibco公司，枸櫞酸鐵胺(FAC)、胎牛血清(FBS)、鈣熒光素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)、羥丙基纖維素均購自美國Sigma公司，甲基纖維素培養基MethoCult GF M3534購自Stem Cell公司，ROS購自碧云天生物技術研究所。Annexin Ⅴ-FITC流式細胞術檢測試劑盒購自BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1臍帶血單個核細胞(UC-MNCs)分離、培養及分組常規分離臍帶血UC-MNCs，RPMI 1640培養液洗滌2遍后，采用完全培養基(含10%胎牛血清的1640培養液)懸浮。細胞以1×106/mL的密度種于12孔培養板中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養24 h。將UC-MNCs分為模型組、丹參多酚低、中、高劑量組及對照組，每組各3個復孔。

1.2.2鐵過載細胞模型建立及鑒定模型組及丹參多酚低、中、高劑量組以FAC 400 μmol/L濃度建立鐵過載細胞模型[3]，于培養第2天加入含400 μmol/L FAC的培養液，此后每24 h使用完全培養基換液，共在400 μmol/L FAC中培養48 h。收集模型組、對照組細胞，用RPMI 1640培養液洗滌2次，調整細胞密度為1×106/mL，加入Calcein-AM，終濃度為0.125 μmol/L，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中孵育15 min，用PBS洗滌2次后，采用流式細胞儀檢測各組細胞的平均熒光強度值，經測模型組、對照組鐵過載熒光強度分別為45.20±8.30、78.21±9.47，模型組熒光強度低于對照組(P<0.05)，證實模型組鐵過載細胞模型建立成功。

1.2.3細胞干預丹參多酚低、中、高劑量組于培養第3天分別加入18、50、160 μg/mL丹參多酚繼續培養24 h。對照組不加FAC及丹參多酚，常規培養96 h。

1.2.4相關指標觀察

1.2.4.1細胞內ROS水平各組細胞培養96 h后，調整細胞密度為1×106/mL，加入10 mmol/L的2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，使其終濃度為1 μmol/L，37 ℃避光溫育20 min，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中，流式細胞儀檢測ROS水平。實驗重復3次。

1.2.4.2細胞凋亡率各組細胞培養96 h后，按照試劑盒說明進行操作，調整臍血單個核細胞密度為1×106/mL。取細胞懸浮液100 μL于流式管中，加Annexin Ⅴ-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL，混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.4.3細胞集落計數細胞培養96 h后，收集各組UC-MNCs，RPMI 1640培養液洗滌2次后重選細胞并計數。在24孔板中進行培養，每孔中甲基纖維素半固體培養基0.5 mL，加入各組MNCs 1×105個。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養7～14 d,于顯微鏡下分別對紅系祖細胞集落形成單位(CFU-E)、?！獑魏讼底婕毎湫纬蓡挝?CFU-GM)、爆式紅系祖細胞集落形成單位(BFU-E)和混合祖細胞集落形成單位(CFU-mix)進行計數。實驗重復3次。

2結果

模型組ROS水平高于對照組及丹參多酚各劑量組(P均<0.05)。模型組細胞凋亡率高于對照組及丹參多酚高劑量組(P<0.05)。模型組細胞CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix集落數量均低于對照組及丹參多酚高劑量組(P均<0.05)。見表1。

±s)

注：與模型組比較，*P<0.05；與丹參多酚高劑量組比較，﹟P<0.05。 3討論

鐵過載是指由于體內鐵過度沉積，導致重要臟器(尤其是肝臟、脾臟、心臟和胰腺等)的結構損害和功能障礙的病理現象，對骨髓造血及血液系統疾病也存在不良影響。鐵過載常見于再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、骨髓纖維化、地中海貧血等疾病。研究發現，鐵過載可抑制骨髓的造血功能[4,5]，該抑制作用主要與激活細胞內的氧化應激反應有關[6,7]，即細胞內鐵過載可誘導ROS升高，而ROS在細胞內過量聚集可直接、間接損傷造血干、祖細胞的數量、分化及功能，最終損傷骨髓造血功能。臍帶血中含有豐富的造血干祖細胞。本研究發現，模型組ROS水平高于對照組，細胞凋亡率高于對照組，CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix集落數量均低于對照組，提示鐵過載可激活細胞內的氧化應激反應，增高細胞ROS水平，從而造成細胞凋亡增加、集落細胞降低，考慮鐵過載可能通過介導氧化應激反應損傷臍血來源的造血細胞增殖、分化功能。

研究發現，去鐵及抗氧化治療可逆轉鐵過載引起的骨髓造血功能損傷[3,6]。去鐵治療可使部分患者肝功能、胰島功能部分甚至全部恢復，并使輸血次數減少、間期延長、骨髓造血功能恢復[6,8]。目前臨床去鐵治療的藥物較少，去鐵胺、去鐵酮、地拉羅司三種藥物雖具有確切的療效，但均具有眼耳毒性、生長遲緩、骨骼改變、血細胞減少、腎功能衰竭等不良反應[9,10]，使用受到一定限制。中藥對于血液系統疾病具有較為肯定的療效，且不良反應少。丹參多酚是丹參的提取物，被廣泛用于抗炎、增強機體免疫力、抗腫瘤、防治心腦血管疾病等。研究發現，丹參多酚是一種有效的抗氧化劑，能顯著清除自由基，抑制由自由基引起的氧化損傷[11]。目前尚未有將丹參多酚應用于鐵過載治療的報道。本研究組前期研究發現，鐵過載患者骨髓單個核細胞內ROS水平升高，通過祛鐵治療、抗氧化治療后骨髓造血功能得到一定程度恢復[12～15]。有報道提示，丹參多酚可降低細胞內ROS水平，清除氧自由基，保護細胞功能[16]。本研究發現，模型組ROS水平高于丹參多酚各劑量組，提示應用丹參多酚后ROS水平降低，可能與丹參多酚減輕鐵過載引起的氧化應激反應有關。本研究發現，模型組細胞凋亡率高于丹參多酚高劑量組，CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix集落數量均低于丹參多酚高劑量組，提示丹參多酚高劑量應用可明顯減輕氧化應激引起的細胞凋亡及其對造血細胞增殖、分化功能的抑制作用，從而促進骨髓造血功能的恢復，推測丹參多酚需要達到較高劑量后方能發揮抗凋亡及促進集落形成作用。

綜上所述， 丹參多酚可減輕鐵過載氧化應激引起的細胞凋亡及對造血細胞增殖、分化功能的抑制作用，其作用機制可能與清除細胞內ROS、減少造血細胞凋亡有關。

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Inhibitory effect of salvianolate on iron overload-derived oxidative stress injury of

hematopoietic cells of umbilical cord blood

MUJuan1, ZHAO Ming-feng, LI Yu-ming, ZHANG Yu-chen, CAO Xiao-li, LI Qing

(1FirstCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:Objective To investigate the protective effect of salvianolate on the iron overload-derived oxidative stress injury of mononuclear cells of umbilical cord blood (UC-MNCs). MethodsThe UC-MNCs were divided into the control group, FAC group, low-dose salvianolate group, medium-dose salvianolate group, and high-dose salvianolate group. The control group received normal culture. The iron overload cell models in the FAC and salvianolate groups were established by adding 400 μmol/L FAC into the culture medium for 24 h on the second day. Then the low-dose, medium-dose and high-dose salvianolate groups were received 18, 50 and 160 μg/mL salvianolate for 24 h, respectively on the third day. Then the levels of reactive oxygen species (ROS), apoptosis rate and LIP level were detected by flow cytometry, respectively. ResultsThe ROS level of the FAC group was higher than that of the control, the low-dose, medium-dose and high-dose salvianolate groups (all P<0.05). The apoptosis rate in the FAC group was higher than that of the control group and high-dose salvianolate group(P<0.05). The counts of colony-forming unit-erythroid (CFU-E), granulocyte-macrophage colony-forming units (CFU-GM), erythropoietic burst-forming units (BFU-E) and mixed progenitor cell colony-forming units (CFU-mix) in the FAC group were significantly lower than those of the control group and high-dose salvianolate group (P<0.05). ConclusionsSalvianolate can reduce the oxidative stress caused by apoptosis and inhibition of proliferation and differentiation of hematopoietic cells.

Key words:salvianolate; iron overload; oxidative stress; apoptosis; hematopoietic stem cells; hematologic diseases

(收稿日期：2014-11-10)

通信作者簡介：趙明峰(1971-)，男，博士后、博士生導師，研究方向為血液病的診斷與治療。E-mail: zmfzmf@hotmail.com

作者簡介：第一穆娟(1981-)，女，研究生在讀，主治醫師，研究方向為血液病的診斷與治療。E-mail:mumu8135@163.com

基金項目：天津市自然科學基金資助項目(13JCYBJC23400)；天津市中醫藥管理局中西醫結合基金資助項目(13120)；天津市衛生局科技基金重點資助項目(2011KR01)。

中圖分類號：R551

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)10-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.001