痛風消停湯對AGA大鼠踝關節炎性因子表達的影響

周天寒，黃學寬，張超男，鄧福忠，王志紅，楊治國，王　玲，楊　玉（.重慶醫藥高等專科學校，重慶　4033；.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶　4033）

痛風消停湯對AGA大鼠踝關節炎性因子表達的影響

周天寒1，黃學寬2，張超男2，鄧福忠1，王志紅1，楊治國1，王玲2，楊玉2
（1.重慶醫藥高等專科學校，重慶401331；2.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶401331）

［摘要］目的：研究痛風消停湯對急性痛風性關節炎（AGA）大鼠受試踝關節滑膜組織炎性因子的影響。方法：60只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組，痛風消停湯低、中、高劑量組，每組10只。正常組常規喂養，其余各組采用尿酸鈉（MSU）溶液注射法建立急性痛風性關節炎模型。造模前2日，正常組與模型組按20mL/kg予以生理鹽水灌胃，秋水仙堿組0.3mg/kg灌胃，1日1次；痛風消停湯低、中、高劑量組分別按2g/kg、4g/kg、8g/kg體質量給予痛風消停湯灌胃，1日1次，直至造模后第7日，連續9日。實驗結束后，檢測血尿酸，采用ELISA法檢測受試踝關節IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，免疫組化法檢測TGF-β及其受體（TGF-βR1）的表達。結果：與正常組比較，模型組大鼠血尿酸、受試踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，痛風消停湯各組大鼠血尿酸、受試踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），而痛風消停湯各組TGF-β1及TGF-βR1的表達較其他各組明顯增強（P＜0.05）。結論：痛風消停湯治療急性痛風性關節炎的機制可能與上調TGF-β1及TGF-βR1的表達、抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的表達有關。

［關鍵詞］痛風消停湯；大鼠；急性痛風性關節炎；炎性因子

［Abstract］Objective：To investigate the effect of Tongfeng Xiaoting Decoction on the inflammatory factors in ankle joint synovial tissue of acute gouty arthritis rats(AGA).Method：60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：normal group, model group, colchicine group and low, medium and high Tongfeng Xiaoting Decoction groups (10 in each group).AGA model was established by induced monosodium urate (MSU) method except the normal group. Two days before AGA model was established, rats in normal and model groups received intra-gastric normal saline(NS) by 20ml/kg.d for qd, colchicine group received colchicine by 0.3mg/kg.d for qd, while those in low, medium and high Tongfeng Xiaoting Decoction groups received Tongfeng Xiaoting Decoction at the liquid of 2g /kg,4g /kg and 8g/kg respectively, once daily, until 7 days after model was formed, continuously for 9 days. After the experiment, serum uric acid was detected, the expression of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 were detected by ELISA and the expression of TGF-β1 and TGF-βR1 were detected by immunohistochemistry. Result：Serum uric acid and the content of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 in ankle joint synovial membrane were increased significantly in the model group compared to that of the normal group（P＜0.05）.Serum uric acid and the content of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 in ankle joint synovial membrane were decreased significantly in Tongfeng Xiaoting Decoction groups compared to that of the model group（P＜0.05）. The expression of TGF-β1and TGF-βR1 in ankle joint synovial membrane were increased significantly in Tongfeng Xiaoting Decoction groups compared to that of the others group（P＜0.05）.Conclusion: The mechanism of treating gouty arthritis by Tongfeng Xiaoting Decoction may be through up-regulating the expression of TGF-β1 ,TGF-rβ1 and inhibiting the expression of IL-1β、IL-6、TNF-αin synovial tissue.

［Key Words］Tongfeng Xiaoting Decoction; acute gouty arthritis; inflammatory Factors

痛風（Gout）是長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高導致組織損傷的疾病，而急性痛風性關節炎（acyte gouty arthritis，AGA）則是痛風的特征性臨床表現。尿酸鈉晶體析出、沉淀于關節腔內，導致大量炎性細胞浸潤，促使關節出現劇烈疼痛、紅腫和功能障礙［1］。痛風消停湯具有清熱解毒、利濕泄濁、化瘀通絡之功，治療痛風有較好臨床療效。我們觀察了痛風消停湯對AGA大鼠踝關節滑膜組織炎性因子的影響，總結如下。

1　材 料

動物：清潔級雄性S D大鼠6 0只，體質量（200±20）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供［動物合格證號SCXK（渝）2012-0001，環境合格證號SYXK（渝）2012-0001］。

藥品與試劑：痛風消停湯由茵陳、苦參、蒼術、車前子、當歸、黃精、秦艽、尋骨風、絡石藤等中藥組成，原藥購自重慶西部醫藥商城有限責任公司，由重慶醫科大學中醫藥學院鑒定，按常規方法自制煎劑，即冷水浸泡30min，煮沸后煎30min，共煎3次，合并藥液，濃縮為含生藥1.0g /mL煎劑。秋水仙堿片（昆明制藥集團股份有限公司），尿酸鈉晶體（美國SIGMA公司），白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α））ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），S-P Rabbit HRP Kit （DAB）兔Streptavidin-HRP試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司），TGF-β1、TGF-βR1 一抗（武漢博士德生物科技有限公司）等。

儀器：AU400全自動生化分析儀，日本OLYMPUS公司；BX51T-PHD-J11型顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；80-2型低速離心機，上海手術器械廠；圖像采集系統CMOS，日本OLYMPUS 公司；Image-Pro Plus，美國Media Cybernetics公司；RM2015型切片機，德國萊卡等。

2　方 法

2.1動物造模與分組

取雄性SD大鼠60只適應性飼養1周后，隨機分為正常組，模型組，秋水仙堿組，痛風消停湯低、中、高劑量組，每組10只。造模前2日開始，按20mL/kg體質量予以生理鹽水灌胃，1日1次，直至造模后7日，連續9日。秋水仙堿組用秋水仙堿混懸液0.3mg/kg灌胃，痛風消停湯低、中、高劑量組分別按2、4、8g/kg體質量給予痛風消停湯灌胃，均從造模前2日開始，1日1次，直至造模后第7日，連續9日。根據文獻方法［2］加以改進，除正常組大鼠外，其余各組大鼠從灌胃第3天開始，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，在大鼠右踝關節后側用6號注射針針口斜面與脛骨成45°夾角方向插入跟腱內側直至踝關節腔，將配置好的（濃度為2.5g/100mL）0.2mL的尿酸鈉溶液注入關節腔內，以關節囊對側鼓脹為注入標準，連續7天。正常組注射同體積生理鹽水，連續7天。

2.2標本采集與指標檢測

大鼠血尿酸檢測。大鼠處置符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。造模第7日，灌胃2h后，按20%烏拉坦5mL/kg體質量進行麻醉，摘取眼球采血3-5mL，靜置1-2h，4000r/min離心10min，分離血清，取上清液，低溫（4℃）保存，按說明書檢測血尿酸。

ELISA法檢測大鼠踝關節IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量。頸椎脫臼處死大鼠，以踝關節為中心上下0.5cm處剪斷，取下受試關節及周圍軟組織，快速切取踝關節滑膜組織，稱重，按1∶5比例加生理鹽水稀釋，4℃勻漿，4000r/min離心5min，取上清液，分裝于Ep管中，按ELISA試劑盒說明書檢測關節滑膜組織浸出液中IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量。

免疫組化SABC法檢測大鼠踝關節TGF-β1及TGF-βR1的表達。以受試踝關節為中心上下0.5cm處剪斷，取相應關節組織放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片。根據免疫組化試劑盒說明書，ABC染色，DBA顯色，復染、脫水、透明、封片，以顯微鏡下細胞胞漿及胞膜內出棕色粒為陽性表達，免疫組化結果采用IHS （immunohistochemical scores）評分：陽性細胞百分比為A，陽性細胞染色強弱為B，IHS = A×B。無陽性細胞則A為0分，陽性細胞為1%～10%則A為1分，陽性細胞為11%～50%則A為2分，陽性細胞為51%～80%則A為3分，陽性細胞為80%～100%則A為4分。染色強度陰性B 為0分，弱陽性為1分，陽性為2分，強陽性為3分［3］。

2.3統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對各組數據進行統計分析，數據以（±s） 表示、采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　結　果

大鼠血尿酸及及受試踝關節滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較見表1。

表1　各組大鼠血尿酸及受試踝關節滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較 （±s）

表1　各組大鼠血尿酸及受試踝關節滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較 （±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別　n　 uric acid （μmol/L）　IL-1β（ng/L）　IL-6（ng/L）　TNF-α（ng/L）正常組　10　106.33±22.01　6.83±0.36　9.15±0.52　20.15±0.92模型組　10　186.72±43.36△　8.97±0.65△　32.57±0.65△　76.57±3.65△秋水仙堿組　10　135.49±32.25△▲　7.44±0.58△▲　17.41±0.59△▲　33.41±1.59△▲痛風消停湯低劑量組　10　138.53±29.74△▲　7.93±0.21△▲　15.62±0.72△▲　35.62±2.72△▲痛風消停湯中劑量組　10　131.26±24.55△▲　7.31±0.83△▲　15.28±0.43△▲　31.78±2.18△▲痛風消停湯高劑量組　10　129.81±35.67△▲　7.28±0.54△▲　14.06±0.41△▲　29.06±1.33△▲

大鼠受試踝關節TGF-β1、TGF-βR1表達比較見表2。

表2　各組大鼠受試踝關節滑膜組織TGF-β1、TGF-βR1表達比較（±s）

表2　各組大鼠受試踝關節滑膜組織TGF-β1、TGF-βR1表達比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別　n　 TGF-β1　 TGF-βR1正常組　10　 2.14±0.05　 2.79±0.13模型組　10　 2.45±0.12　 3.12±0.11秋水仙堿組　10　 2.29±0.16　 2.93±0.17痛風消停湯低劑量組　10　 4.01±0.12△▲　4.39±0.12△▲痛風消停湯中劑量組　10　 4.13±0.26△▲　4.18±0.13△▲痛風消停湯高劑量組　10　 4.09±0.17△▲　4.96±0.21△▲

4　討　論

痛風消停湯方中茵陳、苦參清熱解毒，蒼術、車前子利濕泄濁，秦艽、尋骨風、絡石藤祛風除濕、化瘀通絡止痛，當歸、黃精養血填精和營以固正氣。全方有清熱解毒、利濕泄濁、化瘀通絡之功。藥理研究表明，茵陳有降脂利尿、抗多種病原微生物作用。苦參堿對各種致炎劑引起的急性滲出性炎癥有明顯對抗作用，與氫化可的松作用相似。蒼術、車前子的提取液可抗炎利尿，且有預防腎結石等作用。當歸有鎮痛，抗菌，抗氧化和提高免疫力等作用。黃精則可提高機體的免疫力。秦艽解熱、鎮痛、抗炎，可消除大鼠關節腫脹。尋骨風所含生物堿對類風濕關節炎有較好止痛、消腫、改善關節功能等作用。絡石藤甲醇提取物對動物雙足浮腫、扭體反應有抑制作用，所含尿酸合成酶黃嘌呤氧化酶有顯著抑制作用而能抗痛風。茵陳、蒼術、車前子、黃精等均有降低血尿酸的水平等作用［4］。

研究表明，在痛風性關節炎的病理過程中，尿酸鈉晶體作用于中性粒細胞、滑膜細胞、T細胞、單核細胞、巨噬細胞、血小板釋放多種炎癥介質，如炎性細胞因子、組胺、前列腺素、血小板活化因子（PAF）、微血管增滲酶等，而多種細胞因子可通過自分泌和旁分泌的方式影響痛風性關節炎的發生［5］，其中免疫活性因子TNF-α和白細胞介素-1β（IL-1β）在AGA發病過程中起著非常重要的作用。中性粒細胞-內皮細胞粘連是急性痛風產生的本質，而TNF-α和IL-1β可上調內皮細胞E-選擇素活性及增加中性粒細胞的募集，活化的中性粒細胞與內皮細胞表面黏附分子黏附，進而向關節部位浸潤，釋放炎性介質，引起AGA關節局部炎癥反應的發生［6］。有人認為，TNF-α和IL-1β兩因子作為炎癥的啟動因子，通過與滑膜細胞上IL-1受體相互作用，激活結頭蛋白MyD88，繼而啟動NF-κB觸發繼發性的炎性細胞因子轉錄，從而加重關節損傷［7］；TNF-α也是前炎癥網鏈中一級細胞因子，IL-1β是由TNF-α等誘導的二級前炎癥細胞因子，并能提高TNF-α的活性，兩者之間可能存在反饋機制，共同參與內皮細胞的激活和炎性細胞在體內的募集而加重炎性損傷［8］。因此，降低AGA關節組織中TNF-α和IL-1β的水平，終止炎性細胞因子的惡性循環，則是有效治療AGA的作用環節之一。轉化生長因子β（TGF-β）是一類在發育、免疫反應和組織修復中起調節作用的生長和分化因子，其具有雙向性、多樣性和網絡性，在免疫、炎癥及纖維化性疾病中有重要作用。而轉化生長因子-β1（TGF-β1）是骨關節炎的一個主要調節因子，不僅具有促進炎癥與組織修復的活性，還可以抑制IL-1、IL-6的合成與致炎活性，使干擾素-a（IFN-a）、IFN-γ等的表達降低，有抑制炎癥活性的功能。TGF-β1的增加能抑制AGA患者IL-1β和TNF-α等促炎因子［9］，提示TGF-B1的增高可能抑制了AGA的炎癥反應。TGF-β是通過轉化生長因子β受體（TGF-βR）的信號調節系統作為重要媒介作用于細胞的，因此可通過增加TGF-βR1的含量有效增強TGF-β1對組織器官發揮作用。此外，TGF-β1還可促進蛋白多糖合成，促進關節軟骨合成，促進成纖維細胞I型膠原基因表達，且無疤痕形成［10］。

實驗結果表明，用痛風消停湯后，各組大鼠血尿酸、受試踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低，TGF-β1及TGF-βR1表達提高，提示痛風消停湯治療急性痛風性關節炎的機制可能與上調TGF-β1及TGF-βR1的表達、抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的含量有關，但其機制還有待進一步研究。

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［收稿日期］2015-07-23

［通訊作者］黃學寬

［基金項目］重慶市衛生局科技項目（2010-2-25）

［中圖分類號］R255.689.7

［文獻標識碼］B

［文章編號］1004-2814（2015）10-0888-03