猴頭多糖對小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用及機制探討

姜穎，于英君，劉國良，齊彥，李紅影，孫力( 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱50040;黑龍江中醫藥大學佳木斯學院)

猴頭多糖對小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用及機制探討

姜穎1，于英君1，劉國良2，齊彥1，李紅影1，孫力1
( 1黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱150040;2黑龍江中醫藥大學佳木斯學院)

摘要:目的觀察猴頭多糖對小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用，并從細胞凋亡角度探討其作用機制。方法將50只小鼠腋下皮下注射S180肉瘤細胞，制作腫瘤移植模型。造模成功后隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、環磷酰胺組各10只，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別予猴頭多糖25、50、100 mg/kg灌胃，1次/d，共干預10 d;模型組予生理鹽水0.2 mL/d灌胃，連續10 d;環磷酰胺組予環磷酰胺40 mg/kg腹腔注射，1次/d，共干預5 d。于第10天處死各組小鼠，計算抑瘤率，TUNEL法檢測凋亡細胞，免疫組化法檢測Caspase-3蛋白。結果低劑量組、中劑量組、高劑量組、環磷酰胺組抑瘤率分別為36.36%、57.57%、43.93%、74.24%，環磷酰胺組抑瘤率明顯高于其余各組，中劑量組抑瘤率高于低劑量組、高劑量組，P均＜0.05;凋亡細胞數及Caspase-3蛋白表達為環磷酰胺組＞中劑量組＞高劑量組＞低劑量組＞模型組，P均＜0.05。結論猴頭多糖可抑制小鼠皮下移植肉瘤的生長，以50 mg/kg劑量作用最佳;該作用與其增加Caspase-3蛋白表達、促進腫瘤細胞凋亡有關。

關鍵詞:猴頭多糖;肉瘤;細胞凋亡;凋亡相關蛋白

Inhibitory effect of Hericium erinaceus polysaccharide on mice subcutaneous transplanted sarcoma and its mechanism

JIANG Ying1，YU Ying-jun，LIU Guo-liang，QI Yan，LI Hong-ying，SUN Li
( 1 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Abstract:Objective To observe the inhibitory effect of Hericium erinaceus polysaccharide on the mice subcutaneous transplanted sarcoma，and to explore its mechanism from apoptosis perspective.Methods S180 sarcoma cells were subcutaneously injected into 50 mice to produce the models of subcutaneous tumor transplantation.After successful modeling，the tumor bearing mice were randomly divided into five groups，10 in each group: the low-dose group，medium-dose group，high-dose group，model group and cyclophosphamide group.The low-dose，medium-dose and high-dose groups were given hedgehog polysaccharide 25，50 and 100 mg/kg，orally，once a day，and for 10 days.The model group was given normal saline 0.2 mL/day orally and for 10 days.Cyclophosphamide was administered with 40mg/kg by intraperitoneal injection once a day for 5 days.All the mice were killed after 10 days of treatment.We calculated the inhibition rate of each group.The apoptosis in each group was detected by TUNEL assay.Caspase-3 protein was detected by immunohistochemical method.Results The tumor inhibition rates in the low-dose group，medium-dose group，high-dose group and cyclophosphamide group were 36.36%，57.57%，43.93% and 74.24%.The tumor inhibition rate in the cyclophosphamide group was higher than those in the other groups，and in the medium-dose group，the tumor inhibition rate was higher than those of the low-dose group and high-dose group ( all P＜0.05).The number of apoptotic cells and Caspase-3 protein expression were as follows: cyclophosphamide group＞medium-dose group＞high-dose group＞low-dose group＞model group ( all P＜0.05).Conclusion Hericium erinaceus polysaccharide can inhibit the growth of xenograft sarcoma，and the dose of 50 mg/kg dose is the best.This mechanism may be related to its up-regulation of Caspase-3 protein expression and thereby promoting tumor cell apoptosis.

Key words:Hericium erinaceus polysaccharide; sarcoma; apoptosis; apoptosis-related protein

肉瘤是指來源于間葉組織的惡性腫瘤，多發生于皮膚、皮下、骨膜及長骨兩端。目前臨床常采用手術切除肉瘤再行放、化療的聯合治療方法，但療效較差，不良反應多，且易產生抗藥性［1］。因此，尋找高效、低毒的治療藥物是目前的研究熱點。猴頭多糖是猴頭菌的主要生物活性成分，能提高人體免疫力，抑制腫瘤細胞的增殖［2，3］。目前，猴頭多糖治療肉瘤效果及其作用機制尚不明確。2014年1～10月，我們觀察了猴頭多糖對小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用，從細胞凋亡角度探討其作用機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料健康6～8周齡昆明小鼠50只，雌雄各半，體質量( 20±2) g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，飼養、手術、給藥及取材等環節均嚴格遵守實驗動物科學與管理的有關規定;小鼠S180肉瘤細胞株購自中國科學院細胞庫;猴頭多糖由黑龍江中醫藥大學生物化學與分子生物學實驗室制備;免疫組化檢測試劑盒、兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司; TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;環磷酰胺購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號13110925)。

1.2實驗方法

1.2.1皮下移植瘤模型制備與分組將S180肉瘤細胞( 5×105/mL，每只0.2 mL，腹腔注射)接種于昆明小鼠腹腔培養，在SPF環境飼養下小鼠狀態良好; 7～10 d后抽取腹水，計數細胞后用生理鹽水調整細胞密度至2×107/mL，在小鼠腋下皮下注射S180肉瘤細胞0.2 mL/只。50只接種小鼠在接種后當天隨機分成模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、環磷酰胺組，每組10只。

1.2.2藥物干預接種6 h后，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別予猴頭多糖25、50、100 mg/kg灌胃，1次/d，共干預10 d;環磷酰胺組腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，1次/d，共干預5 d;模型組予生理鹽水0.2 mL/d灌胃，共干預10 d。

1.2.3抑瘤作用觀察干預后稱量各組小鼠體質量，頸部脫臼法處死;完整剝離右前腋下腫瘤組織，冰冷生理鹽水清洗后、濾紙吸干。取模型組之外的各組腫瘤組織，稱重，計算各組抑瘤率。抑瘤率=(模型組平均瘤重－實驗組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.2.4細胞凋亡觀察采用TUNEL法。將腫瘤組織石蠟切片后，PBS漂洗，蛋白酶K室溫孵育;加入轉化劑PDB，在濕盒中孵育; DAB底物溶液顯色，蘇木精復染，封固，40倍鏡下觀察。凋亡細胞呈棕黃色，胞體縮小，核固縮。每張切片選取10個表達最強的視野，計數凋亡細胞。

1.2.5肉瘤組織Caspase-3蛋白表達檢測將腫瘤組織固定，包埋、切片。采用免疫組化法檢測，按試劑盒說明操作。陽性細胞定位于細胞質和細胞核，呈棕黃色。按陽性細胞百分率計分:無陽性細胞為0分; 1%～25%為1分; 25%～50%為2分; 50%～75%為3分; 75%～100%為4分。按染色強度評分:無色為0分;弱陽性為1分;中等強度為2分;強陽性為3分。兩者得分相加為最后評分，以得分平均值表示Caspase-3蛋白表達量［4］。

1.3統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間均數比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組抑瘤率比較低劑量組、中劑量組、高劑量組、環磷酰胺組抑瘤率分別為36.36%、57.57%、43.93%、74.24%。環磷酰胺組抑瘤率明顯高于其余各組，中劑量組抑瘤率明顯高于低劑量組、高劑量組( P均＜0.05)。

2.2各組凋亡細胞比較低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、環磷酰胺組凋亡細胞分別為( 4.600±0.516)、( 10.100±0.875)、( 8.900± 1.398)、( 2.300±0.949)、( 13.600±0.516)個，細胞凋亡數為環磷酰胺組＞中劑量組＞高劑量組＞低劑量組＞模型組( P均＜0.05)。

2.3各組肉瘤組織Caspase-3蛋白表達比較低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、環磷酰胺組的Caspase-3蛋白表達水平分別為( 3.100±0.737)、( 6.600±0.516)、( 4.700±0.948)、( 2.400± 0.699)、( 6.700±0.483)分，Caspase-3蛋白表達水平為環磷酰胺組＞中劑量組＞高劑量組＞低劑量組＞模型組( P均＜0.05)。

3　討論

肉瘤是一種少見且惡性程度高的腫瘤，根據發生部位可分為骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等，預后多不理想。其預后主要取決于治療時機，以及手術是否徹底、有無轉移、患者對放化療的敏感程度等［5～7］。環磷酰胺是臨床應用多年的抗腫瘤藥物，因其抑瘤作用穩定，常被作為陽性對照藥物。

細胞凋亡是一種生理性細胞程序性死亡，發生機制復雜，受多種因素的影響。近年來，通過誘導腫瘤細胞凋亡來治療腫瘤的研究成為熱點。Caspase-3蛋白屬于半胱氨酸蛋白酶家族成員中執行細胞凋亡的

主要蛋白之一，在細胞凋亡過程中發揮重要的功能。有研究表明，Caspase-3能夠破壞細胞的修復作用，引起細胞周期的阻滯［8］;并且，Caspase-3能夠通過降解凋亡抑制蛋白( Bcl-2)而被Caspase家族上游起始蛋白激活，從而形成級聯反應，促進細胞凋亡［9～12］。

研究發現，中藥多糖具有抑制腫瘤細胞增殖、調節生物應答、誘導分化、抑制腫瘤血管系統、逆轉耐藥性、促進細胞凋亡、影響蛋白表達等作用［13］。猴頭多糖是從優質猴頭菇子實體中提取的有效活性成分。《中國藥用真菌》記載，猴頭菌性平，味甘，能利五臟，助消化，滋補，抗癌，治療神經衰弱等。近年研究發現，猴頭多糖是其最重要的活性物質之一，具有調節免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗炎、抗突變、抗輻射等功能。現代醫學認為，其對機體免疫功能的調節是抗腫瘤的重要機制之一。研究發現，猴頭多糖能提高荷瘤小鼠的免疫指數，下調荷瘤鼠腫瘤細胞Bcl-2的表達水平，上調Bax的表達。表明其可通過提高小鼠的免疫功能來達到抗腫瘤的作用。本研究發現，中劑量組抑瘤率最高，提示猴頭多糖中劑量能夠有效抑制小鼠S180肉瘤生長，抑瘤作用較好，但低于環磷酰胺組。中劑量組凋亡細胞數最多，低劑量組凋亡細胞最少。低、中、高劑量組Caspase-3均高表達，以中劑量組最高。提示猴頭多糖可抑制腫瘤增長，可能與調節Caspase-3活性介導小鼠S180細胞凋亡有關。

綜上所述，猴頭多糖可抑制小鼠皮下移植肉瘤的生長，以50 mg/kg劑量作用最佳;該作用與其增加Caspase-3蛋白表達、促進腫瘤細胞凋亡有關。

參考文獻:

［1］馬曉蘭，陶可勝，李靜.腫瘤化療后白細胞減少癥的中西醫治療進展［J］.中國當代醫藥，2015，22( 8) : 16-19.

［2］羅珍，黃萍，郭重儀，等.猴頭菇多糖增強免疫功能的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17( 4) : 182-183.

［3］但飛君，付若秋.猴頭菌的研究概況［J］.中醫藥研究，2000，16 ( 4) : 59-61.

［4］Rahman MA，Dhar DK，Yamaguchi E，et al.Coexpression of inducible nitric oxide synthase and COX-2 in hepatocellular carcinoma and surrounding liver: possible involvement of COX-2 in the angiogenesis of hepatitis C virus-positive cases［J］.Clin Cancer Res，2001，7( 5) : 1325-1332.

［5］周光新，吳蘇稼.軟組織肉瘤化療的研究進展［J］.醫學研究生學報，2013，26( 5) : 532-535.

［6］劉長青，肖邵文，張路，等.軟組織肉瘤術后放療的近期療效觀察［J］.山東醫藥，2013，53( 8) : 9-12.

［7］鄒雲，韓興寶，郭戰軍，等.原發性腎臟滑膜肉瘤1例并文獻復習［J］.山東醫藥，2014，54( 8) : 84-86.

［8］Lee JS，Hong EK.Hericium erinaceus enhances doxorubicin-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Cancer Lett，2010，297( 2) : 144-154.

［9］龐雪利，李礦發，魏蘭，等.IL-8通過上調Bcl-2的表達和下調caspase-3的表達抑制MCF-7乳腺癌細胞凋亡［J］.細胞與分子免疫學雜志，2015，31( 3) : 307-311.

［10］Kim MO，Lee HS，Chin YW，et al.Gartanin induces autophagy through JNK activation which extenuates caspase-dependent apoptosis［J］.Oncol Rep，2015，34( 1) : 139-146.

［11］Zhou GZ，Cao FK，Du SW.The apoptotic pathways in the curcumin analog MHMD-induced lung cancer cell death and the essential role of actin polymerization during apoptosis［J］.Biomed Pharmacother，2015( 71) : 128-134.

［12］Cong PF，Qu YC，Chen JP.Growth inhibition and apoptosis induction by alternol in pancreatic carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2015，21( 15) : 4526-4535.

［13］李玉芳.中藥多糖抗腫瘤機制研究進展［J］.實用癌癥雜志，2007，22( 5) : 546-550.

收稿日期:( 2015-05-25)

通信作者簡介:孫力( 1962-)，女，碩士，教授，研究方向為中藥抗腫瘤的分子生物學機制。E-mail: sunli0129@ hotmail.com

作者簡介:第一姜穎( 1981-)，女，博士，講師，研究方向為中藥抗腫瘤的分子生物學機制。E-mail: jiangying1222@163.com

基金項目:黑龍江省自然科學基金資助項目( 201329) ;黑龍江中醫藥大學校基金資助項目( 201409)。

文章編號:1002-266X( 2015)30-0008-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R73-354

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.003