荊膚止癢顆粒質量標準提高研究

劉和平等

[摘要] 目的 對荊膚止癢顆粒質量標準進行再提高研究。 方法 采用高效薄層色譜法（HPTLC）鑒別處方中君藥荊芥；采用高效液相色譜法（HPLC）測定臣藥野菊花中蒙花苷的含量，色譜條件：Agilent Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-2%冰醋酸水溶液（21∶79）為流動相，柱溫20℃，流速1.0 mL/min，檢測波長334 nm。 結果 荊芥的供試品色譜與對照藥材色譜在相應的位置上有相同的粉紅色斑點，陰性樣品溶液無干擾斑點，方法專屬性強、重復性好；蒙花苷HPLC含量測定方法分離度好、準確度高，蒙花苷在15.26～762.96 ng范圍內呈良好的線性關系，回歸方程Y = 12.7672X + 17.254 18，r = 0.999 98，定量限度為1.83 ng，平均加樣回收率為101.28%，RSD為0.28%（n = 9）。 結論 通過對君藥荊芥和臣藥野菊花的質量控制方法的建立和驗證，提高了荊膚止癢顆粒的質量標準，能更好地監控該產品的質量。

[關鍵詞] 荊膚止癢顆粒；蒙花苷；荊芥；含量；高效液相色譜；高效薄層色譜法

[中圖分類號] R28 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0105-05

荊膚止癢顆粒（批準文號：國藥準字Z10970119）由荊芥、地膚子、野菊花、防風、魚腥草、茯苓、山楂7味中藥及糊精等輔料制成的顆粒劑，用于兒童風熱型或濕熱型丘疹性蕁麻疹的治療[1]。文獻報道，荊膚止癢顆粒對丘疹性蕁麻疹濕熱證和風熱癥的治療效果均較好，且臨床用藥安全[2-4]。本方以輕揚透散、疏風止癢、解毒透疹的荊芥和清熱利濕、祛風止癢的地膚子共為君藥，以清熱解毒散風的野菊花和清熱解毒除濕的魚腥草以及散表祛邪、散風止癢的防風共為臣藥。故野菊花是本方主藥之一，為菊花科植物野菊花（Chrysanthemum indicum L.）干燥頭狀花序，具有清熱解毒、涼肝明目的功效[5]。野菊花含有蒙花苷、木犀草素、金合歡素、芹菜素、異澤蘭黃素等多種有效化學成分[6-8]，蒙花苷是野菊花中重要的黃酮類化合物，研究表明野菊花總黃酮及蒙花苷對葡萄牙假絲酵母具有明顯的抗菌活性等多種作用[9]，是本方的有效成分之一。目前已有報道對野菊花藥材及其制劑中的單一或多種成分進行定量分析[10-12]，均以高效液相色譜法（HPLC）進行測定。荊芥為方中君藥，文獻報道[13-16]，荊芥中除含揮發油，還有橙皮苷、荊芥苷、木犀草素等黃酮類成分。原質量標準只建立了地膚子、野菊花、魚腥草薄層色譜鑒別和防風中5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定，缺乏荊膚止癢顆粒中主要功效成分君藥荊芥的薄層鑒別和對具有明顯抗菌活性作用的蒙花苷的含量測定。為了提高藥品質量標準，更全面地控制產品質量，本研究在原質量標準的基礎上，增加了君藥荊芥的薄層色譜鑒別和臣藥野菊花中蒙花苷HPLC含量測定方法，為荊膚止癢顆粒申報中藥品種保護的質量標準提高提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設備

自動點樣儀LINOMAT 5（瑞士CAMAG）；雙槽展開缸；MICROTEK Scan Maker 3830掃描儀；Agilent 1260快速高效液相色譜儀（含G1311B 四元泵、G1329B自動控溫自動進樣器、G4218A DAD檢測器、Chemstation色譜數據處理工作站，美國安捷倫）；KQ-500VDE型雙頻數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D電子天平（德國賽多利斯）。

1.2 試劑與試藥

硅膠G高效薄層板，青島海洋化工，批號20100808；甲醇（Merck色譜純，批號：1728707408）、乙腈（Merck色譜純，批號：1730130410），乙酸乙酯（分析純，廣州化學試劑廠，批號：20101001-2），甲苯（分析純，廣州化學試劑廠，批號：20071204-2），甲酸（分析純，天津大茂化學試劑廠，批號：111119-1），冰醋酸（分析純，廣東光華化學廠有限公司，批號：20100920）。水為自制超純水，香草醛（分析純，天津大茂化學試劑廠，批號：20091201）。荊芥對照藥材、蒙花苷（Buddleoside）對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號：111528-201107）；10批荊膚止癢顆粒（批號：1005002064、1005012107、1102001108、0706006001、0708008027、0705004105、0708007112、0711009048、0705003058、0911012106）由麗珠醫藥集團四川光大制藥有限公司生產和提供。

2 方法與結果

2.1 荊芥薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品6 g，研細，加甲醇40 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，轉移至分液漏斗中，用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm，確保帶狀點樣的可操作性），取續濾液作為供試品溶液。

2.1.2 陰性溶液制備 取缺少荊芥藥材的陰性樣品6 g，按照供試品溶液制備方法制備荊芥陰性供試液。

2.1.3 對照藥材溶液制備 另取荊芥對照藥材粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm），取續濾液作為對照藥材溶液。

2.1.4 薄層色譜鑒別 照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B），分別吸取供試品溶液和對照藥材溶液及荊芥陰性供試液各10 μL，分別點于同一硅膠G高效薄層板上（條帶狀點樣），以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑，展開8 cm，取出，揮干，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的粉紅色斑點，在與荊芥陰性供試液色譜相應的位置上，沒有相同顏色的干擾斑點（圖1）。

2.2 野菊花中蒙花苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Agilent Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-2%冰醋酸水溶液（21∶79）；柱溫：20℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL，DAD檢測器，檢測波長：334 nm，分離度不低于1.5，理論塔板數以蒙花苷計不低于3000。

2.2.2 對照品溶液制備 取蒙花苷對照品適量，置于有P2O5的真空干燥器中減壓干燥12 h，精密稱定，加甲醇溶解（必要時加熱）制成每1 mL含15 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試液制備 取裝量差異項下的本品，研成細粉末過3號篩，取0.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇超聲提?。üβ?00 W，頻率45 Hz）30 min，取出，放至室溫，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，濾液過微孔濾膜（0.45 μm），取續濾液作為供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 取不含野菊花藥材的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備野菊花陰性對照溶液，吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，分別注入色譜儀中，按“2.2.1”項下色譜條件測定。供試品在與對照品色譜相應的保留時間位置上，有一相同的色譜峰，而陰性對照溶液在此待測組分處無干擾的色譜峰，結果表明方法的專屬性良好（圖2）。

2.2.5 提取溶劑的選擇 取同一樣品粉末（批號：1005002064）0.5 g，平行3份，分別用30%甲醇，70%甲醇和甲醇提取溶劑，按“2.2.3”項下方法制備供試液，測定并記錄色譜圖，結果色譜圖中蒙花苷峰面積分別為2311.33、2673.48和2015.12，表明70%甲醇的提取率最高，故確定70%甲醇作為提取溶劑。

2.2.6 提取時間的選擇 取同一樣品粉末（批號：1005002064）0.5 g，平行3份，分別采用超聲15、30、45 min的方式，按“2.2.3”項下方法制備供試液，測定并記錄色譜圖，結果色譜圖中蒙花苷峰面積分別為1683.38、1788.92和1798.98，表明超聲30 min，基本可以提取完全，故提取方式選用超聲30 min。

2.2.7 柱溫比較 精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），分別采用了不同柱溫15、20、25、30、35℃，按照“2.2.1”項下色譜方法測定并記錄色譜圖，結果表明，20℃時色譜圖的主要色譜峰分離度及響應值最佳，故色譜柱溫度選擇20℃。

2.2.8 流速比較 精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），分別采用了0.8、1.0、1.2 mL/min的流速，按照“2.2.1”項下色譜方法測定并記錄色譜圖，結果表明，流速為1.0 mL/min時色譜圖的主要色譜峰分離度較佳，故流動相的流速選擇1.0 mL/min。

2.2.9 色譜柱比較 精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），分別采用不同品牌的色譜柱Discovery C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Zobrax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），按照“2.2.1”項下色譜方法測定并記錄色譜圖，結果表明，Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱主要色譜峰分離度較佳。再精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），分別采用同一型號Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同批次的色譜柱（批號：B10207、B11281、B10126），按照“2.2.1”項下色譜方法測定并記錄色譜圖，實驗結果不同批次色譜柱的蒙花苷色譜峰面積RSD<2%（n = 6），表明，所選用的同一型號Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同批次的色譜柱重復性良好。

2.2.10 流動相耐受性 精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），改變流動相比例±5%，按照“2.2.1”項下色譜方法測定并記錄色譜圖，試驗結果各色譜圖中蒙花苷的分離度均達到1.5以上，表明本方法的流動相耐受性良好。

2.2.11 線性關系考察 分別精密吸取濃度為15.26 μg/mL的對照品溶液1、2、4、6、10、15 μL，以及濃度為76.296 μg/mL的對照品溶液5、10 μL，注入液相色譜儀中，按照“2.2.1”項下色譜條件測定。以對照品絕對量為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得到線性方程Y=12.7672X+17.254 18，r=0.999 98。結果表明，蒙花苷在15.26～762.96 ng范圍內，呈良好的線性關系。將濃度為15.26 μg/mL的對照品溶液稀釋25倍，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣3 μL，測定，得到的色譜峰峰高約為基線的10倍，對照品相對應的量1.83 ng，即定量限度為1.83 ng。

2.2.12 儀器精密度 精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），按照“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定，蒙花苷色譜峰面積的RSD值為0.24%（n = 6），結果表明儀器精密度良好。

2.2.13 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：1005002064），按照“2.2.1”項下色譜條件分別在第0、1、3、6、12、24、48 h不同的時間點測定，蒙花苷色譜峰的面積RSD值為0.44%（n = 7），結果表明供試品溶液在48 h內基本穩定。

2.2.14 重復性試驗 取同一樣品（批號：1005002064）粉末，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果蒙花苷平均含量為0.149%，RSD值為0.84%（n = 6），表明本法重復性良好。

2.2.15 準確度試驗 取已知蒙花苷含量的同一樣品（批號：1005002064）粉末，平行9份，以80%、100%、120%三個水平分別加樣，按“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，“2.2.1”項下色譜條件進行測定，每組蒙花苷加樣平均回收率在95%～105%之間，RSD均<1%（n = 9），結果表明本方法準確度良好（表1）。

2.2.16 樣品測定 取10批荊膚止癢顆粒樣品粉末，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果見表2。

根據樣品測定數據，考慮本品生產的實際情況，暫定本品每袋含野菊花以蒙花苷（C28H32O14）計算不得少于1.0 mg。

3 討論

3.1 檢測指標的選擇

荊膚止癢顆粒（批準文號：國藥準字Z10970119）為麗珠醫藥集團股份有限公司的獨家品種，已上市多年，產生了較大的經濟效益，為了申報中藥品種保護，需要在原質量標準的基礎上，開展質量標準提高研究。荊芥為方中君藥，主要含揮發油、橙皮苷、荊芥苷、木犀草素等成分。原標準中沒有荊芥的鑒別，曾分別對荊芥的揮發性成分和橙皮苷的鑒別進行了條件摸索，但均無法排除陰性干擾，故建立了以荊芥對照藥材為參照的薄層色譜鑒別方法。野菊花為方中的臣藥，處方用藥量大，所含的蒙花苷為本品主要抗菌類成分之一，《中國藥典》2010年版一部野菊花含量測定是以蒙花苷為含測指標，所以本實驗建立了蒙花苷含量測定方法。新建立的荊芥薄層鑒別和蒙花苷含量測定方法，操作簡便、結果可靠、重復性好，使原質量標準得到提高，為荊膚止癢顆粒申報中藥品種保護提供技術支持。

3.2 薄層鑒別項

在文獻研究的基礎上，本實驗曾摸索了展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）、甲苯-吡啶-甲酸（36∶9∶5）、甲苯-甲醇-乙酸（35∶5∶5）、甲苯-三氯甲烷-丙酮（40∶25∶35）、甲苯-甲醇-丁酮（60∶20∶20）、甲苯-吡啶-甲酸（36∶9∶5）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1），結果黃酮類成分薄層色譜經典展開劑甲苯-乙酸乙酯-甲酸系統的分離效果最好。比較了不同的顯色劑5%的三氯化鋁乙醇溶液、10%的硫酸乙醇溶液、5%的香草醛濃硫酸溶液，結果目標成分在香草醛濃硫酸溶液下顯粉紅色斑點，故選擇5%的香草醛濃硫酸溶液作為顯色劑。比較了不同生產廠家的高效薄層板和普通薄層板，結果德國Merck公司生產的普通硅膠G薄層板和高效硅膠G薄層板的分離度均符合要求，青島海洋化工廠生產的高效硅膠G薄層板的分離度符合要求，但其普通硅膠G薄層板的分離度達不到要求，不能使用。薄層色譜鑒別采用瑞士CAMAG公司的自動點樣儀進行條帶狀點樣，為了確保帶狀點樣的可操作性，點樣前需要將供試品溶液過0.45 μm微孔濾膜。條帶狀點樣量為10 μL，如果采用手動點狀點樣，點5 μL即可。點樣后將薄層板放置于有五氧化二磷的真空干燥器中，減壓干燥1 h后再展開，以控制薄層板的濕度，達到較好的分離效果。

3.3 含量測定項

采用HPLC法測定蒙花苷的含量，參照文獻報道[13-17]，曾比較了流動相乙腈-0.1%磷酸（25∶75）、乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫、甲醇-0.1%磷酸（55∶45）、乙腈（A）-0.1%磷酸（B）水溶液梯度洗脫、乙腈-1.0%醋酸水溶液梯度洗脫、甲醇-水-冰醋酸（52∶46∶2），結果乙腈-2%冰醋酸水溶液（21∶79）為流動相的分離效果最佳，且陰性無干擾。蒙花苷為黃酮類成分，在紫外區有明顯吸收，根據《中國藥典》2010年版一部“野菊花”含量測定項下以及蒙花苷的光譜圖，選擇確定檢測波長為334 nm。

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（收稿日期：2015-01-05 本文編輯：張瑜杰）