高效液相色譜—熒光聯合測定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量

趙瑞

[摘要] 目的 探討高效液相色譜-熒光聯合測定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量方法的可行性。 方法 采用高效液相色譜-熒光聯合測定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量，Agilent 1200高效液相色譜儀Bond Elut C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相：甲醇-水-冰醋酸（82∶18∶0.1）；流速：1.0 mL/min；熒光檢測波長：294 nm。 結果 線性關系考察中，以進樣量為橫坐標（X，g），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得回歸方程：Y=3800X-0.7300（r = 0.9998）。紫丁香苷在0.026～0.750 g范圍內與峰面積呈良好的線性關系。對3批藥材樣品中紫丁香苷的含量進行測定，結果紫丁香苷的平均含量為1.113 mg/g，RSD為0.53%。 結論 本研究建立的高效液相色譜-熒光聯合檢測法靈敏度高，能快速、準確地測定舒肝快胃丸中紫丁香苷濃度，方法可行。

[關鍵詞] 高效液相色譜-熒光；舒肝快胃丸；紫丁香苷；含量測定

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0110-04

中醫學認為，人是一個整體，臟腑之間互為影響。肝若過熱，會影響胃液的分泌，即肝氣犯胃。以五行學說解釋，肝屬木，脾屬土，而木克土，因此肝火過盛會令胃部同樣過熱不適。肝氣犯胃憂思惱怒、飲食不節暴飲暴食、脾胃虛弱病后脾胃受損等均可導致胃痛的發生。上述病因，既可單獨致病，又往往相互影響，而出現寒熱互見、虛實錯雜、陰陽并損之證候，臨證時必須靈活掌握。可見胃痛的關鍵是“氣”，所謂不通則痛。因此治療胃痛的關鍵是理順胃氣。舒肝快胃丸由厚樸（姜制）、陳皮、青皮、丁香、香附（醋制）、枳實、川芎、延胡索、姜黃、牡丹皮、白芍、砂仁、當歸、吳茱萸等20味中藥制成的丸劑，氣香，味辛、微苦[1-5]。具有舒肝理氣、化滯消脹的效果，主要治療肝胃不和所致的兩肋脹痛，胃脘刺痛，惡心嘈雜嘔吐酸水[6-10]。目前《中國藥典》2010年版一部已給出了部分君藥及臣藥如厚樸中有效成分的要求，但關于丁香中主要成分紫丁香苷的測定報道較少。為進一步控制藥品質量，保證患者的用藥安全及效果，筆者參照國內較多文獻擬建立一種靈敏、準確、操作便捷的檢測方法，作為紫丁香苷質量控制的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（自動進樣系統）、美國Supelco公司固相萃取儀（USA SUPELCO SPE），紫外檢測器，安捷倫Bond Elut C18固相萃取小柱（100 mg，1 mL），YOKO-XR薄層加熱器，CAMAG雙波長紫外觀察箱，Camag Nanomat4點樣儀，HX-02B薄層顯色用的加熱板，真空干燥箱，旋轉蒸發儀，KQ5200DA超聲儀，水浴鍋，Sartorius BT125D電子天平。

1.2 材料

紫丁香苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：11574-201501，供含量測定用）；甲醇（色譜純）；水為超純水；其余試劑均為分析純；舒肝快胃丸（陜西辰濟藥業有限公司，國藥準字Z20155396，規格：200丸/瓶，批號：2015010101、2015010102、2015010103）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Bond Elut C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm，Sigmar公司）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（82∶18∶0.1）；流速：1.0 mL/min；熒光檢測波長：294 nm。理論塔板數以紫丁香苷計算應不低于3000。

2.2 對照品儲備液的配制

精密稱取紫丁香苷對照品5.00 mg，用流動相定容于50 mL量瓶中，使成100 μg/mL的對照品儲備液，置于-4℃冰箱保存。

2.3 供試品儲備液的配制

取本品適量，研細，精密稱取1.014 g，置20 mL量瓶中，加入甲醇超聲處理10 min（功率100 W，頻率50 kHz），放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過，取續濾液即為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方制備缺丁香的樣品，研細，精密稱取1.014 g，置20 mL量瓶中，加入甲醇超聲處理10 min（功率100 W，頻率50 kHz），放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過，取續濾液制備成陰性樣品溶液。

2.5 系統適用性試驗

取對照品、供試品和陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果陰性樣品在紫丁香苷對照品出峰處未出現色譜峰，表明陰性樣品對紫丁香苷的測定無干擾。具體色譜圖見圖1。

2.6 線性關系考察

精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加10 mL/L鹽酸甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液。在上述色譜條件下分別吸取10 μL進樣測定，以進樣量為橫坐標（X，g），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得回歸方程：Y=3800X-0.7300（r = 0.9998）。結果提示，紫丁香苷在0.026～0.750 g范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗

取對照品溶液（濃度為0.090 mg/10 mL），連續進樣5次，10 μL/次，測定紫丁香苷的峰面積，結果見表1，提示該方法有較高的精密度。

2.8 重復性試驗

取樣品5份（批號：2015010101），研細，精密稱取1.014 g，置20 mL量瓶中，加入甲醇超聲（功率100 W，頻率50 kHz）處理10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過，測定其含量，結果見表2，提示該方法重復性較強。

2.9 穩定性試驗

取樣品6份（批號：2015010101）0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL，分別置于20 mL量瓶中，加入甲醇超聲（功率100 W，頻率50 kHz）處理10 min，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過，每個濃度共做2份，1份室溫放置，1份于-20℃下保存備用。取室溫濃度質控樣品分別于制備后0、2、4、6、8 h后進行樣品分析，計算血藥濃度及RSD值，結果顯示，紫丁香苷RSD分別為2.03%、2.11%、1.24%，提示樣品溶液室溫放置8 h穩定性良好；取-20℃下保存液樣品，解凍后再冷卻，進行數據分析，測定5 d內血液樣品的濃度及RSD值，結果顯示，紫丁香苷RSD分別為2.23%、2.20%、2.67%，提示樣品溶液在-20℃下放置5 d內基本穩定。

2.10 加樣回收試驗

精密稱取樣品0.5 g，共9份，置25 mL容量瓶中，分別精密吸取1 mL濃度為0.5 mg/mL的紫丁香苷對照品溶液，轉移至25 mL量瓶中，測定紫丁香苷，計算加樣回收率。分別精密加入新鮮配制的0.5005 mg/mL紫丁香苷對照品溶液1.5、1.5、1.5、2.0、2.0、2.0、2.5、2.5、2.5 mL，加入甲醇適量，超聲（功率400 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下的色譜條件進行含量測定并計算回收率，結果見表3。

2.11 樣品含量測定

對3批藥材樣品（批號：2015010101、2015010102、2015010103）進行紫丁香苷含量測定，結果見表4。

3 討論

凡由于脾胃受損、氣血不調所引起胃痛難耐胃脘部疼痛的病證，均可稱之為胃脘痛。《素問·六元正紀大論》曰：“民病胃脘當心而痛。”《醫學正傳》說：“古方九種心痛……詳其所由，皆在胃脘，而實不在于心”。導致胃痛原因常見的有寒邪客胃、肝氣犯胃、飲食傷胃、脾胃虛弱等。若寒邪客于胃中，寒凝不散，阻滯氣機，可致胃氣不和而疼痛；肝對脾胃有疏泄作用，惱怒抑郁，氣郁傷肝，肝失條達，橫逆犯胃，均可引發胃痛的發生，若勞倦內傷，久病脾胃虛弱，或稟賦不足，中陽虧虛，胃失溫養，內寒滋生，中焦虛寒而痛；當過食肥甘，食滯不化，氣機受阻或饑飽無度，飲食不節，胃失和降可導致胃痛；另氣郁日久，氣滯血瘀，瘀血內結，中焦氣機受阻，而致胃痛發作。可見，胃痛發生的病機有虛實兩端之意，實證為氣機阻滯，不通則痛；虛證為胃腑失于溫煦或濡養，失養則痛。

臨床上舒肝快胃丸藥理作用主要有促進胃排空，抑制胃酸分泌，加快腸道運動，緩解疼痛等，其是由香附（醋制）、丁香、白芍、佛手、木香、郁金、白術（炒）、陳皮、柴胡、廣藿香、炙甘草、萊菔子、檳榔（炒焦）、烏藥等研制而成的中藥制劑，輔料為蜂蜜。舒肝快胃丸可發揮各種中藥之功效，功能主治舒肝解郁、和胃止痛。常用于兩脅脹滿，食欲不振，呃逆嘔吐，胃脘疼痛，大便失調。其主要成分之一丁香中的紫丁香苷是一種強效抗肝毒藥物，其恢復微粒體酶系統的酶活性及抑制脂質過氧化作用可以促進肝毒物代謝并改善肝功能使之正常化，并兼有止血功效。目前關于丁香中主要成分紫丁香苷的測定報道較少。為建立一種快速、靈敏的紫丁香苷的測定方法，本研究考察了諸多文獻報道[11-18]，選取C18柱固相萃取方法，比較甲醇、乙腈等多種溶劑對樣品雜質的洗脫情況，最終發現經一定比例的甲醇和緩沖液洗脫，既能有效除去雜質[19-24]，又能保證紫丁香苷的高回收率，所得色譜圖分離完全，無測定干擾，不僅操作簡便，而且重現性較好。

3.1 流動相的選擇

本研究考察了不同濃度的甲醇-水-冰醋酸溶液，發現有機相的種類、濃度對舒肝快胃丸中紫丁香苷出峰時間的影響較大，且冰醋酸可消除色譜峰拖尾現象[25-29]。最后選定甲醇-水-冰醋酸（82∶18∶0.1）為流動相，紫丁香苷的峰形較好，保留時間適宜，與其他雜質峰達到基線分離，效果較為理想。

3.2 提取方法的選擇

采用超聲提取法，分別以不同提取時間（10、20、30 min）提取后，進行測定，結果顯示，超聲處理10、20、30 min的提取結果差異不顯著，為保證提取效率，故采用超聲（功率100 W，頻率50 kHz）處理10 min為提取方法，分別以甲醇、水、10 mL/L鹽酸甲醇作為提取溶媒，超聲提取10 min后進行比較。結果顯示，以水為溶媒的提取結果略高于其他溶媒，但是用水作溶媒時，由于極性增大，雜峰較多，紫丁香苷的峰形較差[30-32]；而以甲醇作溶媒時基線較為平穩，色譜峰對稱[11-12，29，31-33]，故選擇甲醇超聲提取10 min。

綜上所述，本文建立的高效液相色譜-熒光聯合檢測法靈敏度高，能快速、準確地測定舒肝快胃丸中紫丁香苷濃度，并通過陰性輔料干擾試驗和一系列破壞性試驗證明，該方法的專屬性強，耐用性好，且可控制舒肝快胃丸的質量。

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（收稿日期：2015-03-25 本文編輯：李亞聰）