MMP—9與TIMP—1在復發性流產中的基因表達及相關性研究

蔣德菊等

[摘要] 目的 檢測MMP-9、TIMP-1在復發性流產絨毛組織中的mRNA相對表達量，研究MMP-9和TIMP-1的表達失衡與復發性流產的相關性。 方法 選取2013年4～12月我院婦科門診正常早孕和復發性流產婦女的絨毛組織各19例和28例，RT-PCR檢測MMP-9、TIMP-1的相對表達量。 結果 復發性流產組絨毛MMP-9 mRNA的相對表達量為4.11±0.42，正常早孕組絨毛MMP-9 mRNA的相對表達量為2.45±0.36，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）；復發性流產組絨毛TIMP-1 mRNA相對表達量為7.62±1.54，正常早孕組絨毛TIMP-1相對表達量為8.41±1.02，兩組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 復發性流產絨毛組織中的MMP-9 mRNA表達量顯著下降，TIMP-1 mRNA表達量升高，MMP-9和TIMP-1的表達失衡參與了復發性流產的發生、發展。

[關鍵詞] 復發性流產；MMP-9；TIMP-1

[中圖分類號] R714.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）08（a）-0093-04

自然流產連續發生≥2次稱為復發性流產，復發性流產臨床較常見，近年來其發病有上升趨勢，嚴重影響患者的身心健康，影響家庭幸福和社會健康發展，因此探求復發性流產的發病機制，為臨床治療和預防復發性流產提供科學依據有重要意義。本研究采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測不明原因復發性流產和正常早孕絨毛組織中MMP-9及TIMP-1 mRNA相對表達量，通過比較兩組MMP-9和TIMP-1的基因表達水平，探討MMP-9和TIMP-1動態失衡與復發性流產發生、發展的關系，從分子水平研究復發性流產的發生、發展機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2013年4～12月在我院婦科門診就診患者，年齡18～35歲，月經周期5～7/28～30 d，停經45～60 d，經臨床婦科檢查、β-HCG和孕酮、彩超證實為宮內妊娠，自愿選擇人工流產的宮內妊娠活胎19例和復發性流產28例（自然流產≥2次，各項檢查提示胚胎停育）。流產前兩組病史、年齡、孕產次、停經天數均無明顯差異。

1.2標本采集

1.2.1 正常早孕組19例 彩超提示：宮內單活胚。常規負壓吸宮術選取吸出物中的絨毛組織，液氮凍存。

1.2.2 復發性流產組28例 彩超提示：宮內妊娠未見胎心，結合β-HCG和孕酮，確診為胚胎停育，行負壓吸宮術，留取絨毛組織液氮凍存。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑 DNA Extraction kit （BioFlux），Taq polymerase（BioCer），Realtime PCR Master Mix（BioCer），Probe GAPDH（BioRad），Probe MMP9和TIMP1（BioRD）均購于深圳市中生生物技術公司。

1.3.2 組織總RNA提取 ①取10～30 mg組織塊，放入6 mm陶瓷研缽中，加入液氮，剪成1 mm見方小塊，用陶瓷研磨杵充分研磨，直至成粉；②將研磨好的粉末迅速轉入1.5 ml離心管中，離心管中預先加入 600 μl Trizol溶液，充分顛倒混勻，室溫靜置5 min；③轉移上清液至吸附柱中，吸附柱套上新的離心管，12 000 r/min，離心30 s；④棄去外套管中液體，向吸附柱中加入600 μl洗脫液，12 000 r/min，離心30 s；⑤重復步驟④一次；⑥棄去管中液體，空柱12 000 r/min，離心1 min；⑦將吸附柱轉移到新的離心管，加入20 μl洗脫液，12 000 r/min，離心30 s。管中液體即為提取的總RNA溶液，立即用于下游實驗或-80℃凍存。

1.3.3 目的基因和內參基因引物序列及產物特征 見表1、圖1。

圖1顯示部分目的基因擴增曲線的情況，橫坐標表示PCR循環數，縱坐標表示基因表達量的熒光度，基因擴增曲線與橫線的交匯點表示CT值，目的基因表達濃度越高，CT值越小。A：TIMP-1基因擴增曲線；B：MMP-9基因擴增曲線

圖1 目的基因擴增曲線圖

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MMP-9、TIMP-1基因平均CT值的比較

現在常用的兩種分析實時定量PCR實驗數據的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數；相對定量方法是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異。2-ΔΔCT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。MMP-9平均CT值的差值=6.87-3.51=3.36， 2-ΔΔCT=0.097，即復發性流產組絨毛MMP-9 mRNA表達量相當于正常早孕組的0.097倍；TIMP-1平均CT值的差值=8.74-12.14=-3.398，2-ΔΔCT=10.54，即復發性流產組絨毛TIMP-1 mRNA表達量相當于正常早孕組的10.54倍（表2）。

2.2 兩組mRNA相對表達量的比較

復發性流產組絨毛MMP-9 mRNA的平均表達量為4.11±0.42，相當于正常組絨毛的0.097倍（2-ΔΔCT=0.097，表2），較正常早孕組表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）；復發性流產組絨毛TIMP-1平均表達量為7.62±1.54，相當于正常早孕組絨毛的10.542倍（2-ΔΔCT=10.54，表2），較正常早孕組表達升高，差異無統計學意義（P=0.65）（表3）。

3 討論

復發性流產在育齡婦女中的發生率約為1%[1]。復發性流產不僅給孕婦帶來心理創傷，甚至會影響到以后的妊娠結局[2]，可能導致日后不孕。約50%的復發性流產病因尚未明確[3]，滋養細胞具有高度增殖和浸潤性生長的潛能[4]，但在正常胚胎植入和胎盤形成時，滋養細胞不會發生過度增殖，侵襲性生長具有嚴格的時間性和空間性，限于孕早期及子宮壁的1/3處，提示機體可能通過細胞因子調控滋養細胞的生長，使其保持動態平衡。

細胞外基質（ECM）是細胞之間的物質，是由大分子構成的錯綜復雜的網絡，是阻止細胞浸潤性生長的重要屏障[5]?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解和再塑造細胞外基質的Zn2+依賴性中性蛋白酶家族，對維持細胞外基質的動態平衡起重要作用。MMPs組織抑制劑（TIMPs）可以阻斷體內MMPs所起的作用，胚胎滋養層和蛻膜中均有MMPs和TIMPs表達，兩者間的平衡對于基質的重建和侵襲程度的控制起重要作用。MMPs低表達將會導致滋養細胞侵襲不足，影響胚胎的著床和正常生長發育，導致流產[6]。MMP-9是參與滋養層細胞侵入子宮內膜的主要蛋白質[7]。TIMP-1可以拮抗MMP-9，阻止子宮內膜細胞外基質被MMP-9過度降解，阻止滋養層細胞的過度浸潤[8-10]。但各學者研究結果不盡相同，Kuznetsova等[11]研究發現，MMP-9水平表達低者流產的危險性增加；Iwahashi等[12]研究提示，MMP-9通過分解Ⅳ型和Ⅴ型膠原參與流產過程；李萍[13]的研究認為MMP-9在先兆流產蛻膜組織中表達高于正常早孕組。呂薈明等[14]研究認為，TIMP-1 mRNA的表達量在流產組顯著降低。姜廣利等[15]研究認為，正常早期妊娠的蛻膜和絨毛MMP-9和TIMP的平衡表達是維持正常早期妊娠的必要條件。

本實驗結果表明，復發性流產組絨毛MMP-9 mRNA的相對表達量較正常早孕組表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）；復發性流產組絨毛TIMP-1 mRNA相對表達量較正常早孕組表達升高，但差異無統計學意義。根據本實驗結果推測：復發性流產組MMP-9表達量下降，TIMP-1較正常組表達升高，導致滋養細胞侵襲不足，胚胎著床過淺，胚胎血供營養不足，影響胚胎正常生長發育而致流產，MMP-9和TIMP-1的動態失衡參與了復發性流產的發生、發展，與大部分學者的研究結果基本一致，為復發性流產的婦女藥物阻斷MMP-9和TIMP-1的失衡，提高妊娠成功率提供了理論依據和新思路。然而兩者對生殖過程各環節的精細調節機制有待進一步研究。

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[15] 姜廣利，陳娟，劉宇.早期自然流產患者絨毛中MMP-9mRNA和TIMP-3 mRNA的表達[J].新醫學，2010，1（41）：38-40.

（收稿日期：2015-04-03 本文編輯：王紅雙）