超聲輔助提取結合高效液相色譜

曹玉嬪+閆麗珍+黃紅麗+鄧必陽

摘 要 用蛋白酶K和脂肪酶作為提取劑、用超聲波輔助提取牛蒡和三七樣品中的硒形態。建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用技術測定牛蒡和三七樣品中硒代胱氨酸（SeCys2）、亞硒酸鹽[Se]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸鹽[Se]的新方法。用8 mmol/L pH 5.0的檸檬酸作為流動相，在8 min內可分離4種硒形態。利用CH4作為DRC反應氣體，可消除了40Ar40Ar+對80Se+的干擾，提高了準確度。SeCys2、Se、SeMet和Se的檢出限分別為0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL，相關系數（R2）均大于0.9995，加標回收率范圍為95.1%～114.6%，RSD<3%。將本方法應用于牛蒡和三七中硒形態分析，結果令人滿意。

關鍵詞 硒； 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜； 牛蒡； 三七； 超聲提取

1 引 言

硒是人體必需微量元素之一[1，2]，具有清除體內自由基、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金屬毒性等生物學功能[3]。許多疾病的發生與硒的攝入量偏低有關，硒的攝入量低于每日30 μg，就會出現衰老，易發心肌炎及其他疾病[4]；攝入量高于每日耐受上限400 μg，就會導致頭發指甲易斷、皮膚粗糙、腸胃功能紊亂、易怒以及神經功能障礙等[5]。體內硒的適宜濃度范圍很窄[6]，其生物有效性以及毒性在很大程度上取決于硒的化學形態[1，7，8]。

目前，對硒形態分析常采用液相色譜（LC）[9，10]、氣相色譜（GC）[11]、毛細管電泳（CE）[12] 等分離手段，采用電感耦合等離子體質譜 （ICP-MS）[7，10]、電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-AES）[1]、原子吸收光譜（AAS）[13]及原子熒光光譜（AFS）[14]等檢測手段。

牛蒡（Burdock）又名東洋參、牛鞭菜，為菊科牛蒡屬二年生草本植物[15]。牛蒡是我國傳統的藥食同源植物，具有疏散分熱、解毒消腫的功效。自從牛蒡子中分離得到牛蒡苷以來，牛蒡的食用和藥用價值也越來越受到人們的重視。但牛蒡中硒形態分析尚未見報道。

三七是五加科人參屬植物三七（Panax notoginseng）的根，是中國特有藥用植物，產于我國的西南部的云南、廣西、江西、四川、湖北等地，當地民間發掘使用源遠流長[16]。三七是一種常年生中藥，作為一種傳統中草藥已有超過600年的歷史[17]。三七有多種藥理學活性，常用于治療心血管疾病、腦血管疾病、炎癥、外傷和出血等[18～20]。目前已報道了三七中無機硒形態[21，22]，但三七中有機硒形態未見報道。

電感耦合等離子體質譜 （ICP-MS） 法具有靈敏度高、線性范圍寬、多元素多同位素同時檢測、干擾少等優點。高效液相色譜 （HPLC） 具有多種不同的分離模式，強大的分離能力和重現性好等優點。HPLC與ICP-MS聯用，在靈敏度、準確度和分析速度等方面表現出優勢，而且接口相對簡單，因此HPLC-ICP-MS廣泛應用于元素形態分析。超聲波輔助提取（USAE）具有提取速度快、提取效率高及操作簡便等優點。本實驗集中了USAE、HPLC及ICP-MS的優點，建立了USAE-HPLC-ICP-MS聯用的新方法，并用于牛蒡和三七樣品中硒形態分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

NexIon 300X 型ICP-MS儀器（美國PerkinElmer公司）配備一個動態反應池（Dynamic Reaction Cell， DRC）系統，樣品溶液通過Meinhard玻璃霧化器和玻璃旋流霧室引入到ICP-MS；Flexar液相色譜儀（美國PerkinElmer公司）由Flexar Binary LC Pump和Flexar solvent manager組成，配備Flexar LC Autosampler；Hamilton PRP-X100分析柱（250 mm×4.1 mm， 10 μm， 瑞士Hamilton公司）， Hamilton PRP-X100 保護柱（20 mm×2.1 mm， 10 μm，瑞士Hamilton公司）；色譜柱與ICP-MS霧化器用PEEK管連接；Titan MPS微波消解儀（美國PerkinElmer公司）；SK3310HP超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；TG16-W微量高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；DZF-300真空干燥箱（鄭州長城科工貿有限公司）；Purelab Option超純水系統（英國ELGA公司）。

硒標準溶液（GSB G62029-90（3401），1000 μg/mL，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院）；SeO2（AR，北京市朝陽區中聯化工試劑廠）；Na2SeO4（AR，天津市化學試劑研究所）；硒代胱氨酸（SeCys2，純度98%，北京百靈威公司）；硒代蛋氨酸（SeMet，純度99%，美國Alfa公司）；脂肪酶（AR，北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶K（20 mg/mL，天根生化科技（北京）有限公司）； HNO3、H2O2 （超純，蘇州晶瑞化學有限公司）；甲烷（99.999%，大連大特氣體有限公司）；檸檬酸、乙酸、氨水、磷酸二氫銨、甲酸（AR，西隴化工股份有限公司）。質譜調諧液（美國PerkinElmer公司）為Be， Mg， In， U， Ce濃度都為1 μg/L混合標準溶液。實驗用水為超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 總硒的測定 牛蒡和三七樣品均購于桂林市藥店。將樣品置于真空干燥箱中低溫烘干，研細混合均勻，過100目篩。稱取上述樣品0.2000 g于消解罐中，加入6 mL HNO3和1 mL H2O2，按照表1微波消解程序進行消解。消解結束后，冷卻，打開消解罐，樣品溶液轉移至25 mL容量瓶中，用超純水洗滌3次，合并洗滌液，再用超純水定容，搖勻備用。同樣方法制備試劑空白溶液。按照表2中ICP-MS條件進行測定。

2.2.2 硒形態分析方法 稱取牛蒡和三七樣品各0.5000 g于10 mL離心管中，加入2 mL超純水，1 mL 20 mg/mL蛋白酶K和10 mg脂肪酶，在超聲頻率為53 kHz和37℃水浴中超聲處理1.5 h，然后以6000 r/min離心15 min，重復提取二次，將提取液合并，用水稀至10 mL，搖勻備用。同樣方法制備試劑空白溶液。所有溶液測定前經0.45 μm水性濾膜過濾。按照表2操作條件，進行測定。

3 結果與討論

3.1 流動相類型及濃度的選擇

考慮到應盡量采用簡單和無毒試劑作為流動相，本實驗選擇磷酸二氫銨和檸檬酸作為流動相進行考察分析。當NH4H2PO4作為流動相時，Se保留時間約30 min，并且SeMet信號強度較低。當用檸檬酸溶液作為流動相時，可實現4種硒形態在8 min內完全分離，且檸檬酸作為流動相時成分單一，配制簡單，因此，本實驗選擇檸檬酸溶液作為流動相。

考察了檸檬酸濃度對4種硒形態保留時間的影響，如圖1。隨著檸檬酸濃度的增大，Se的保留時間逐漸減小，當檸檬酸濃度達到10 mmol/L時，SeMet的保留時間與Se的保留時間重疊，當檸檬酸濃度為8 mmol/L時，4種硒形態在8 min內均能良好分離。因此，本實驗選擇檸檬酸濃度為8 mmol/L。

3.2 檸檬酸酸度的影響

在確定了流動相的組成和濃度后，考察了不同酸度條件下檸檬酸對硒形態分離效果的影響。本實驗采用20% NH3·H2O調節檸檬酸的酸度，在pH 4～6范圍內，4種硒形態保留時間見圖2。隨著pH值增大，Se的保留時間逐漸減少。當pH=4時，Se的保留時間為14.33 min；當pH=6.0時，SeMet和Se已經重疊，只出現3個峰；當pH=5時，4種硒形態分離效果最佳。因此，本實驗選擇檸檬酸溶液的pH=5。

3.3 流動相流速對保留時間的影響

為了得到最佳的分離度，實驗考察了流動相流速對硒形態保留時間的影響，圖3 使用CH4（a）和O2（b）作為DRC氣體時的色譜圖

Fig.3 Chromatograms of selenium species using CH4（a） and O2（b） as dynamic veaction cell （DRC） gas

Concentrations of SeCys2， Se， SeMet and Se are 5 ng/mL each. The detection conditions are shown in Table 2 except CH4隨著流動相流速的增大，4種硒形態的保留時間均逐漸縮短，當流動相流速達到1.7 mL/min時，SeCys2與Se分不開。綜合考慮，本實驗流動相的流速選擇為1.5 mL/min。

3.4 動態反應池（DRC）條件的優化

硒在自然界中有6種同位素，80Se+的豐度最大，然而80Se+容易受到ArAr+的干擾，而ArAr+是ICP中常見的離子，因此本實驗選擇DRC技術消除干擾。本實驗分別使用O2和CH4作為DRC反應氣，考察其對于80Se+的干擾消除情況。當SeCys2， Se， SeMet和Se的濃度均為5 ng/mL 時，分別用O2和CH4作為DRC反應氣時，混合標準溶液色譜圖見圖3。當O2作為DRC氣體時，實驗檢測的是96SeO+，而96SeO+容易受到96Mo+的干擾，鉬在植物中含量較高，因此難以完全消除干擾。當加入CH4作為DRC反應氣時，CH4與40Ar40Ar+反應，消除了40Ar40Ar+對于80Se+的干擾。在植物硒形態分析中，甲烷消除干擾的能力及硒形態的峰強度均優于用O2作為DRC氣體。因此，本實驗選擇CH4作為DRC反應氣體。

3.5 ICP-MS檢測條件的優化

RF功率、霧化氣流速等工作參數是ICP-MS較重要的參數，這些參數對信號強度以及對氧化物和氫氧化物的形成有較大的影響。本實驗采用PE公司提供的ICP-MS調諧溶液選定ICP-MS工作參數見表2。在最佳工作條件下得到的考察指標是： Be為4625 cps/（ng/mL）， Mg為44827 cps/（ng/mL），In為50930 cps/（ng/mL），U為41670 cps/（ng/mL），CeO+/Ce+為1.9%，Ce++/Ce+為0.9%。所有考察指標滿足ICP-MS性能要求，因此所選條件符合實驗要求。詳細ICP-MS工作參數見表2。

3.6 分析性能

SeCys2， Se， SeMet和Se的檢出限分別為0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL（n=6，3σ），線性范圍分別為0.28～200 ng/mL，0.10～200 ng/mL，0.65～200 ng/mL和0.50～200 ng/mL，相對標準偏差（RSD，n=6）分別為3.2%， 2.5%， 3.5%和2.9%，相關系數R2>0.9995，用峰面積定量，其分析性能見表3。

3.7 提取劑的選擇及樣品分析

理想的預處理方法既能夠有選擇性地將各種含硒化合物從植物固態基體中高效提取出來，還要盡量避免在處理過程中對天然存在的各種含硒化合物造成損失，保證提取前后形態不會發生轉變。根據文獻報道，蛋白酶K和脂肪酶提取效果較好[23]，因此，本實驗采用蛋白酶K-脂肪酶作為提取劑。為了便于比較，本實驗也使用超純水作為提取劑，考察提取效率。本實驗利用超聲波輔助酶提取需時1.5 h，而文獻報道硒形態的提取時間為24 h[2]，因此本方法大大縮短了提取時間。分析結果見表4。

4 結 論

利用超聲波輔助蛋白酶K-脂肪酶進行樣品前處理，建立了HPLC-ICP-MS聯用技術測定牛蒡和三七樣品中SeCys2， Se， SeMet和Se的新方法。結果表明，本方法簡便，快捷，在8 min內可將4種硒形態良好分離，方法重復性和精密度較好，可滿足植物中硒形態分析的需要，為植物中硒形態分析提供了一種可行的分析方法。

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