血液中15N標記氨基酸同位素豐度

雷雯等

摘 要 以硅烷化試劑N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）對氨基酸加以衍生，建立了衍生化15N標記丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和尿素同位素豐度的氣相色譜-質譜聯用檢測方法。在優化的色譜和質譜條件下，5種衍生化物均得到基線分離。通過對5種衍生化物的EI質譜圖進行解析，選擇合適的特征碎片離子作為同位素豐度的計算依據，并采用同位素峰簇算法計算同位素豐度，實現了多種化合物同位素豐度同時測定。以高豐度15N標記氨基酸和尿素對照品對方法進行驗證，方法的精密度優于0.15%，同位素豐度相對偏差小于1.4%。本方法已成功用于測定動物血液中15N標記的4種氨基酸和尿素的同位素豐度。

關鍵詞 同位素豐度； 氨基酸； 氣相色譜-質譜聯用； 氮同位素標記

1 引 言

在生物醫學領域，穩定同位素標記氨基酸常作為示蹤劑對生物體的新陳代謝[1]進行表達或用于蛋白質合成率[2]的測定，同時也被用于蛋白質定量組學[3]。通過將標記的氨基酸如甘氨酸-15N、丙氨酸-15N、谷氨酸-15N等經靜脈注射入生物體內，通過測定血液、尿液或組織樣品中同位素豐度則可計算出蛋白質的更新率、合成率和分解率等，而尿素是代謝過程中的最終產物，因而監測尿素-15N2的同位素豐度也可提供相應的代謝信息?！禖ell》雜志近期報道了以同位素標記的谷氨酰胺和葡萄糖作為示蹤劑，得到在MYC癌基因表達及缺氧的條件下細胞中谷氨酰胺的代謝情況，從而指導癌癥疾病的靶向治療的研究[4]。血液或組織液中標記氨基酸同位素豐度的準確測定直接影響到了代謝過程的精準表達。氣體同位素質譜法可用于化學純度較高的單一氨基酸同位素豐度的測定[5]。而實際血液或組織液樣品中基質較為復雜，氨基酸含量較低[6～8]，其同位素豐度的檢測則是難點所在。Nakamura等[9]使用LC-MS/MS分析了老鼠血漿氮代謝循環中多種氨基酸15N與14N的同位素豐度比（（M+1）/M），從而反應出15N在老鼠不同部位的富集情況。江驥等[10]采用衍生化-氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用法測定了血漿中15N標記甘氨酸的同位素豐度。在13C代謝流分析中，有報道使用GC-MS測定了大腸桿菌、酵母等微生物中或菌體蛋白中13C標記氨基酸同位素豐度[11，12]。目前還未有GC-MS同時測定血漿或組織液中15N標記多種氨基酸同位素豐度的報道。本研究采用GC-MS法研究血液中15N標記丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和尿素的同位素豐度同時測定的方法，首先在優化的GC-MS條件下對上述5種化合物進行分離，分析每種氨基酸衍生物在EI譜圖的碎裂規律，找出適用于15N同位素豐度計算的碎片離子，建立同位素豐度計算方法； 進而對高豐度氨基酸和尿素對照品進行測定， 以驗證方法的準確性； 最后對實際血液樣品進行分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS/MS，7890B-7000C，美國Agilent公司）； HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm， 美國Agilent公司）； 超純水系統（美國Merck Millipore Simplicity公司）； 低溫高速離心機（韓國Heraeus）； 電子天平（美國Ohaus，精度0.01 mg），氮吹儀（上海安譜科技有限公司）。

硅烷化試劑N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA， 美國RegisTechnologies公司）； 天然豐度氨基酸對照品丙氨酸（純度98.5%）、甘氨酸（純度99%）、谷氨酸（純度98.5%）、天冬氨酸（純度98.5%）均購于上海惠興生化試劑有限公司； 尿素（純度98.5%，美國USP公司）； 穩定同位素15N標記丙氨酸（純度98%，豐度98.52%），甘氨酸（純度98%，豐度98.10%），谷氨酸（純度98%，豐度98.11%），天冬氨酸（純度98%，豐度98.07%），尿素-15N2（純度99%，豐度98.14%）均為上海化工研究院同位素所研制產品，同位素豐度由氣體同位素質譜儀測定，作為高豐度對照品使用； 動物血液樣品（羊血液，西南大學提供），甲酸（HPLC級，CNW公司）； 乙腈（LC-MS級，Scharlab公司）； 吡啶和甲氧胺（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 天然豐度對照品：分別稱取1.0 mg甘氨酸、1.2 mg丙氨酸、1.8 mg天冬氨酸、2.0 mg谷氨酸、1 mg尿素于1.5 mL氣相進樣瓶。40℃下真空干燥2 h，加入2%甲氧胺吡啶溶液600 μL，充分溶解混合后，放入烘箱37℃下預混合1 h。加入600 μL MSTFA，60℃下反應2 h，待GC-MS分析。高豐度對照品的處理方法同天然豐度對照品。

血液實際樣品：取待測血樣1 mL，加入9 mL丙酮于25 mL離心管中充分混合，在4000 r/min下離心10 min，然后取上清液，氮吹至干燥，加入2%甲氧胺吡啶溶液300 μL，充分溶解混合后，放入烘箱37℃下預混合1 h。加入300 μL MSTFA，60℃下反應2 h，經0.22 μm濾頭過濾后待GC-MS分析。

2.2.2 實驗條件 色譜條件：色譜柱：Agilent HP-5 MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 載氣He（99.999%），流速1.0 mL/min； 進樣口溫度290℃； 升溫程序：初始100℃， 以40℃/min升溫至160℃，再以10℃/min升溫至250℃，最后以20℃/min升溫至300℃； 進樣量1.0 μL，分流比50∶1。

GC-MS質譜分析條件：電子轟擊離子源（EI），電離能量70 eV； 全掃描（Scan）模式，掃描范圍m/z 50～400； 離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度300℃。

3 結果與討論

3.1 GC-MS圖譜分析

對氣相色譜升溫程序進行了優化，在優化的色譜條件下，按照出峰順序，天然豐度丙氨酸、尿素、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸均基線分離，且峰型良好，總離子流圖（TIC）如圖1a所示。高豐度對照品與天然豐度對照品保留時間一致，如圖1b所示。

3.2 衍生化氨基酸特征離子解析

通過對GC-MS的TIC圖進一步解析，可以得到每種氨基酸的EI質譜圖。氨基酸在與MSTFA衍生化試劑反應后，其結構和分子量均發生了變化。以丙氨酸為例，氨基端的和羧基端的氫原子分別與硅烷化試劑反應，相對分子量由89變為233，如圖2所示。其余氨基酸的反應機理與甘氨酸相似，尿素則為兩個氨基酸的氫與硅烷化試劑反應，反應后各物質的相對分子量列于表1。

在上述物質衍生物的EI譜圖中，分子離子峰幾乎完全碎裂為碎片離子，對于15N同位素豐度的計算，需要選擇帶有N原子的碎片離子進行計算，并且為了減小誤差，該碎片離子最好為基峰或者具有較高的峰強度。以丙氨酸為例，天然豐度標準品的EI質譜圖如圖3a所示。丙氨酸衍生物的分子離子峰完全碎裂為碎片離子，其中m/z 116的碎片離子結構如圖4中方框中所示，其中N原子為標記位點（圖中*為15N標記位點），因此該碎片離子可用于同位素豐度計算。由圖3b可見，高豐度丙氨酸的特征離子為m/z 117，與圖4中標記位點相符。尿素、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的特征離子選擇原則與甘氨酸類似，特征離子的碎裂情況和相對分子量均列于表1。

3.3 同位素豐度計算

以丙氨酸衍生物為例，天然豐度的特征離子m/z 116具有天然的同位素分布，包括m/z 116，117和118的同位素峰簇，其天然的同位素豐度比為100∶12.8∶4.5，歸一化之后為0.852∶0.109∶0.038。相應的，15N標記的特征離子所對應的峰為m/z 117，其同位素峰簇為m/z 117，118和119，如表2所示。然而，在實際樣品中可能會出現不完全標記的情況，質譜圖中同時存在C5H1414NSi +·和C5H1415NSi +·兩種離子，定義以上兩種離子的摩爾分數分別為X0和X1，二者相對分子質量差1 dalton，這兩種離子均具有一致的同位素分布，即同位素峰簇的峰強比一致，定義A0i和A1i分別為X0和X1在m/z=i時的峰強，從而得出式（1）。在實測質譜圖中m/z 60 ～ 63范圍內的質譜峰強度為兩種離子同位素峰簇的疊加，定義Amixi為實測質譜圖在m/z=i時的峰強，則有式（2）～（5）。

同時，各類離子摩爾分數之和應該為1，因此x0 +x1=1。由于方程個數大于未知數，因此使用式（1）～（3）即可求解，通過聯立解方程組，求得兩種離子的摩爾分數。進而，由式（6）求得丙氨酸的15N同位素豐度。由于氨基酸的標記個數為1個，因此所得到分子百分比等于氨基酸的原子百分比。

使用相同的方法，結合表1中的特征離子和表3中的天然同位素分布，可對甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸進行計算，結果列于表3。由于15N標記的尿素有兩個標記位點，因此在實際樣品中會出現C6H17OSi214N14N+·，C6H17OSi214N15N+·和C6H17OSi215N15N+·這種情況，需要定義這3種離子為x0，x1和x2，相似的方法聯立方程組求得3種離子的分子百分比。由于尿素-15N2的標記個數為2個，其15N 原子百分比與分子百分比不同，需要使用式（6）求解，計算結果列于表3。由于天然豐度分布的基準同樣為衍生化后的特征離子，因此衍生化試劑所引入同位素豐度變化可以在計算過程中被抵消，所得到衍生化氨基酸的同位素豐度值即為目標氨基酸的同位素豐度。

由表3可見，方法精密度良好，符合檢測要求。其中，4種氨基酸的精密度均小于0.1%，1： Alanine， 2： Urea， 3： Glycine， 4： Aspartic acid， 5： Glutamic acid.尿素為0.1%。上述5種高豐度化合物由同位素質譜儀測定的同位素豐度對照值同樣列于表3，計算值與對照值基本符合，相對偏差均小于1.4%。

因此，所發展的同位素豐度計算方法可以滿足測定需求。

3.4 實際血液樣品的檢測

對血液樣品進行前處理，使用方法進行分析，GC-MS離子流圖如圖5所示，圖中可以識別40余個峰，其中種目標化合物均被檢出。丙氨酸、尿素、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸衍生物的EI質譜圖如圖6所示，每種化合物的保留時間與天然豐度對照品一一對應（圖1a），特征離子與表1一致。通過質譜圖（圖6）中特征離子峰簇，計算得出同位素豐度值列于表4。因此，所發展的方法可以成功測定血液中氨基酸和尿素的同位素豐度值。

4 結 論

建立了衍生化-氣質聯用測定血液中丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和尿素同位素豐度的方法。對衍生化的氨基酸和尿素的EI質譜圖進行解析，選擇了包含同位素標記位點且峰強度較高的碎片離子作為同位素豐度的計算依據，使用同位素峰簇算法對同位素豐度進行計算。使用高豐度的氨基酸和尿素對照品對方法進行驗證，方法的精密度優于0.15%，同位素豐度相對偏差小于1.4%。方法還可以擴展至生物體組織、尿液等實際樣品中氨基酸或尿素的同位素豐度檢測。

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