一株降解甲醇微生物的篩選及其培養(yǎng)

沈壽國++張媚紫++方超林++葉勁松

摘 要：該文以甲醇作為唯一碳源，從甲醇馴化的土壤中分離到一株甲醇降解菌，對其形態(tài)特征及培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌菌落為乳白色，菌體為短桿狀，革蘭氏陰性，其生長最佳條件為：氮源（NH4）2SO4，pH值7.5，溫度30℃，甲醇濃度為1.5%。

關(guān)鍵詞：甲醇降解菌；篩選；培養(yǎng)

中圖分類號 X703 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1007-7731（2015）23-26-02

1引言

甲醇作為一類重要的有機(jī)化工原料，是制造各種藥品、染料、農(nóng)藥、噴漆等的原料，同時(shí)也是一種重要的污染物，廣泛存在于石油化工、有機(jī)合成及塑料等生產(chǎn)廢水中。隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展，工廠所排放的廢氣、廢水中的甲醇含量明顯增多，危害著人類健康[1-2]。由于甲醇的生物可降解性很強(qiáng)，其生物處理方法有著較為廣闊的應(yīng)用前景，不僅能在治理污染的同時(shí)節(jié)約能源，還能在代謝后轉(zhuǎn)化出抗菌素、氨基酸、蛋白質(zhì)等有用的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生多重效益[3-4]。

2 材料與方法

2.1 甲醇降解微生物的篩選

2.1.1 培養(yǎng)基的配制 稱取2g（NH4）2SO4，0.5gMgSO4，0.5gK2HPO4，0.01gCoCl2，0.01gMnSO4，0.01gCuSO4，0.01g FeSO4，溶于1 000mLH2O中，即為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。再加入18g瓊脂，于121℃滅菌20min，待其冷卻至50℃，加入15mLCH3OH，搖勻后倒平板，即為實(shí)驗(yàn)篩選培養(yǎng)基。

2.1.2 菌種篩選 將甲醇馴化土壤采取倍倍稀釋法，制取不同濃度菌懸液，取0.1mL不同稀釋倍數(shù)菌懸液分別涂布于篩選培養(yǎng)基上于32℃恒溫培養(yǎng)觀察；對菌落形態(tài)拍照，并對其進(jìn)行革蘭氏染色觀察。將純化菌種接種斜面。

2.2 甲醇降解微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 制備菌體懸浮液 將純化菌種斜面加入10mL無菌水，并用移液槍吹吸均勻，即為該實(shí)驗(yàn)菌懸液。

2.2.2 不同氮源下培養(yǎng) 吸取1mL菌懸液，加入體積為100mL含有以甲醇（1%）為碳源，分別含有0.2%（w/v）硝酸鉀、硫酸銨、尿素、蛋白胨為氮源無菌培養(yǎng)基，于32℃、160r下培養(yǎng)觀察，并拍照記錄。

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng) 吸取1mL菌懸液，分別加入含有優(yōu)化氮源的100mL無菌液體培養(yǎng)基，優(yōu)化轉(zhuǎn)速下，分別置于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃溫度下，于160r下培養(yǎng)5d，取培養(yǎng)液在OD600nm測其吸光度。

2.2.4 不同pH下培養(yǎng) 吸取1mL菌懸液，分別加入含有優(yōu)化氮源的100mL無菌液體培養(yǎng)基，將pH分別調(diào)整為5.5、6、0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，于28℃、160r/min培養(yǎng)5d，取培養(yǎng)液在OD600nm測其吸光度。

2.2.5 不同甲醇濃度條件下培養(yǎng) 吸取1mL菌懸液，分別加入到含有0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（V/V）甲醇的100mL選擇培養(yǎng)基中，置搖床160r下中培養(yǎng)5d，取培養(yǎng)液測OD600nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌落的形態(tài)特征 在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7d，可以觀察到甲醇降解菌的菌落如圖1所示，菌落呈微白色，表面光滑。經(jīng)革蘭氏染色后菌體呈紅色，短桿狀。因此鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌。

注：圖A為菌落的形態(tài)特征，圖B為顯微觀察拍照。

3.2 不同氮源對甲醇降解菌生長的影響 氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)的重要組成成分；由于微生物多樣性，微生物在不同的氮源培養(yǎng)基中生長狀況是有差別的[25]。從圖2可以看出，該菌株以蛋白胨為氮源的生長狀況最好，硫酸銨為氮源的生長狀況次之，在硝酸鉀中不生長。

注：氮源分別為硫酸銨、尿素、蛋白胨、硝酸鉀。

3.3 溫度對甲醇降解菌生長的影響 從圖3可以看出，隨著當(dāng)溫度較低時(shí)基本不生長，當(dāng)溫度達(dá)到28℃微生物生長活躍，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，微生物生長最好；之后隨后隨溫度的升高，微生物生長變慢，該菌最適生長溫度為30℃。

圖5 甲醇含量對菌株生長的影響

4 討論與結(jié)論

多數(shù)甲醇降解菌菌落紅色，屬于甲基桿菌類[5-6]，該菌為革蘭氏陰性短桿菌，菌落白色，不屬于甲基桿菌類。該菌對蛋白胨利用最好，有機(jī)氮源通常會(huì)降低微生物對有害炭氮源的利用[7-8]，因而選擇硫酸銨作為該菌處理甲醇最佳氮源。合適的溫度和pH有利于菌體的生長代謝，過高或過低都會(huì)影響菌體的生長，從而影響甲醇降解。甲醇濃度較低時(shí)，生長所需能源碳源均不足，生長緩慢，甲醇濃度過高對菌體造成毒害，生長不利。由本次研究可知：該實(shí)驗(yàn)菌株在處理甲醇廢水選擇條件為氮源硫酸銨，溫度30℃、pH7.5，甲醇濃度為1.5%。

參考文獻(xiàn)

[1]宋志文，陳冠雄，馬放，等.微生物固定化處理甲醇廢水的實(shí)驗(yàn)研究[J].微生物學(xué)雜志，2000，20（4）：30-31.

[2]左雅慧，蔣德群.一株高效處理甲醇廢水細(xì)菌的研究[J].微生物學(xué)雜志，2002，22（2）：58-59.

[3]林伯荃，汪景幫，黨平，等.甲醇細(xì)菌的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1983，10（6）：248-251.

[4]朱相遠(yuǎn)，劉寶順，董建忠.嗜甲醇酵母的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1986，13（3）：110-113.

[5]李寶慶，鹿秀云，李社增，等.甲醇降解菌的篩選、鑒定及其特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)2007，26（增刊）：410-413.

[6]Owen Jenkins，David Byrom，Dorothy Jones.Methylophilus：a New Genus of Methanol-Utilizing Bacteria，Interational Journal of Systematic Bacteriology，1987：446-448.

[7]Melike Balk，Jan Weijma，Alfons JM Stams.Therm otoga lettingaesp.nov.，a novel thermophilic，methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor[J].International Journalof of Systematic and Evolutionary M -icrobiology，2002，52：1361-1368.

[8]Wander W Sprenger，Martine C van Belzen，Jorg Rosenberg，etal.Methanom-icrococcus blatticola gen.nov.，sp.nov.，a methanol-and ethylamine-reducing methanogen from the hindgut of the cockroach Perip laneta Americana[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50：1989-1999.

（責(zé)編：張宏民）