凋亡相關基因c-myc在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

凋亡相關基因c-myc在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

安金路蔣軍廣孫曼崔永亮張艷梅郭世放宋衛衛

(鄭州大學第一附屬醫院河南省呼吸疾病研究所河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討凋亡相關基因c-myc在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及臨床意義。方法免疫組織化學法檢測c-myc在NSCLC(50例)及正常肺組織(20例)中的表達，TUNEL法檢測凋亡細胞并計算凋亡指數(AI)。結果c-myc在NSCLC及正常肺組織間表達差異有統計學意義(χ2=9.150，P=0.002)。c-myc在腺癌中的表達率高于在肺鱗癌中(χ2=5.918，P=0.015)。高分化組織的陽性表達率高于中分化和低分化(χ2=7.888，P=0.019 )。淋巴結轉移者陽性率高于無淋巴結轉移者(χ2=4.327，P=0.038)。TNM Ⅲ期和Ⅳ期陽性率高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=7.484，P=0.006)。c-myc與細胞凋亡指數呈負相關(r=-0.784，P=0.000)。c-myc的表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、腫瘤位置、胸腔積液無明顯關系(P>0.05)。結論c-myc與NSCLC的發生、進展、臨床分期、惡性程度關系密切。

關鍵詞〔〕c-myc；肺腫瘤；細胞凋亡；免疫組織化學

中圖分類號〔〕R734.2〔

基金項目：河南省科技攻關重點項目(102102310133)

通訊作者：蔣軍廣(1963-)，男，碩士生導師，主任醫師，教授，主要從事呼吸疾病的基礎與臨床研究。

第一作者：安金路(1990-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸疾病的基礎與臨床研究。

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤。腫瘤和凋亡關系密切，腫瘤發生的一個重要原因是誘導凋亡基因失活，抑制凋亡基因過度表達。目前對c-myc在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及臨床意義已有研究，結果并不一致，而c-myc與細胞凋亡的關系研究尚少。本研究探討c-myc在NSCLC中發生、發展中的作用，期望為NSCLC的預防、診斷、治療提供實驗依據。

1對象與方法

1.1對象隨機選取鄭州大學第一附屬醫院病理科2010～2012年經我院胸外科切除的NSCLC標本50例，年齡44～77歲，年齡≥60歲28例，<60歲22例；所有患者手術前均未接受放化療及其他治療且病理診斷明確。按照美國聯合癌癥分類委員會和國際抗癌聯盟制定的TNM分期標準進行分期〔1〕。其中男33例，女17例；鱗癌27例，腺癌23例；高分化9例，中分化26例，低分化15例；有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移26例；TNM分期Ⅰ期加Ⅱ期共31例，Ⅲ期加Ⅳ期共19例；吸煙23例，不吸煙27例；腫瘤直徑>3 cm者32例，≤3 cm者18例；腫瘤位于左側20例，右側30例；有胸腔積液者9例，無胸腔積液者41例。另選取20例距NSCLC癌旁3 cm以上正常組織(病理證實)為對照組。

1.2方法

1.2.1主要試劑Rabbit Anti-MTLC/c-myc、羅氏TUNEL凋亡檢測試劑盒、免疫組化染色試劑盒來自北京博奧森生物技術有限公司；濃縮型DAB試劑盒來自北京中杉生物工程公司。

1.2.2S-P法染色50例NSCLC組織及20例正常肺組織切片放入60℃恒溫烤箱里30 min；梯度酒精脫蠟、水化；磷酸鹽緩沖液(PBS)抗原修復；3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性；非免疫性動物血清阻斷非特異性反應；滴加一抗，放入4℃冰箱過夜；第2天滴加生物素化標記的二抗；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素；DAB顯色；蘇木素復染；梯度酒精脫水；中性樹膠封片。

1.2.3TUNEL法烤片、脫蠟、脫水；Proteinase K工作液處理癌組織切片；TUNEL反應混合液處理肺癌組織；滴加converter-POD；DAB顯色；蘇木素復染；梯度酒精脫水；中性樹膠封片。

1.2.4陽性結果判斷免疫組化結果判定：c-myc在肺鱗癌中的主要表達在細胞質，肺腺癌中主要表達在細胞質，陽性表達均呈現棕黃色顆粒。從兩方面進行定量判斷，①陽性染色程度：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②染色細胞百分率，高倍鏡(400倍)下每個視野計數100個細胞，每張切片隨機挑選10個視野，計算陽性細胞數占總癌細胞數百分比，<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。兩個定量數字相加，總分值<4分為陰性，≥4分為陽性。

細胞凋亡陽性結果判定：利用TUNEL法，腫瘤細胞核被染為棕黃色，用光學顯微鏡，計數每1 000個腫瘤細胞中凋亡細胞的個數并進行統計學分析。需排除嚴重的炎癥反應和壞死灶，避免造成假陽性結果〔2〕。凋亡細胞指數(AI)=凋亡細胞數/計數總細胞數。

1.3統計學處理應用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、直線相關性分析。

2結果

2.1c-myc表達與臨床病理的關系c-myc經免疫組化后，細胞胞質和(或)胞核被染成棕黃色，肺癌組織陽性率為60.0%(30/50)，正常組織陽性率為20%(4/20)，兩者差異顯著(χ2=9.150，P=0.002)，但c-myc在癌組織的染色均深于正常組織。結果顯示，c-myc在腺癌中的表達率高于在鱗癌中(χ2=5.918，P=0.015)，在高分化組織的陽性表達率高于中分化和低分化(χ2=7.888，P=0.019)。淋巴結轉移者c-myc陽性率較無淋巴結轉移者的陽性率高(χ2=4.327，P=0.038)。TNMⅢ期和Ⅳ期c-myc陽性率高于Ⅰ期和Ⅱ期陽性率(χ2=7.484，P=0.006)。c-myc的表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、腫瘤位置、有無胸腔積液無明顯關系(P>0.05)，見表1。

表1　c-myc的表達與NSCLC臨床病理特征關系〔 n(%)〕

2.2c-myc與細胞凋亡直線相關分析表明，隨著表達c-myc分值越高，細胞的凋亡指數越低，與凋亡呈負相關(r=-0.784,P=0.000)。其中0分AI值9.67±1.15，1～2分AI值為7.25±1.24，3～4分AI值為5.14±0.71，5～6分AI值為3.50±0.48 。

3討論

人類腫瘤(宮頸鱗癌〔3〕、肝癌〔4〕、食管鱗癌〔5〕等)中大多可檢測到c-myc的表達異常,c-myc原癌基因激活的主要方式是c-myc的擴增和過度表達〔6〕。李雪婷等〔3〕利用原位雜交技術檢測c-myc mRNA的表達從CINⅠ-Ⅱ～CINⅢ直至發展到鱗癌的過程中，陽性率明顯升高，c-myc基因在CIN病變即被激活，持續存在并逐漸積累于發展為宮頸鱗癌的整個癌變過程中。范平明等〔5〕應用流式細胞術發現MMP-14和c-myc在食管鱗狀細胞癌組織中高表達且有協同，MMP-14、c-myc的表達與食管鱗癌細胞患者的預后有關。

項鋒鋼等〔7〕發現Bmi-1、c-myc蛋白在NSCLC的陽性表達率及強度均顯著高于正常肺組織。與本實驗結果一致，提示c-myc在NSCLC發生發展中起作用，上調c-myc的表達，可導致腫瘤細胞增生、浸潤，導致NSCLC的發生，c-myc可能成為肺癌早期診斷標記物及治療靶點。Nakashima等〔8〕發現高Wnt3表達腫瘤在肺鱗狀細胞癌比在肺腺癌更高。Wnt3基因表達與c-myc的表達和survivin的表達明顯相關。本實驗結果提示c-myc可能成為肺腺癌早期診斷標記物及治療靶點〔9〕。王革平等〔10〕研究發現高分化癌中c-myc 的表達低于中低分化癌，分化從高到低c-myc表達呈拋物線狀趨勢。項鋒鋼等〔7〕也發現c-myc的陽性表達與肺癌的分化程度有關，分化程度越高，陽性率越高。本實驗結果提示c-myc上調可能與腫瘤的惡性程度有關，對其進行檢測有可能提示NSCLC惡性程度。但賴習華等〔9〕、簡麗萍等〔11〕、辛彩霞等〔12〕發現c-myc的表達與組織分化程度無統計學意義。這些文獻研究結果不一致的原因可能與樣本組織高中低分化程度、樣本數量等因素有關。項鋒鋼等〔7〕發現c-myc的陽性表達與肺癌的淋巴結轉移有關。趙云霞等〔13〕發現c-myc表達淋巴結轉移有明顯關系。本實驗結果提示c-myc表達上調與NSCLC淋巴結轉移有一定關系。項鋒鋼等〔7〕研究結果c-myc陽性表達與肺癌的TNM分期有統計學意義。本實驗結果提示c-my與NSCLC的發生、進展、預后有關。另外c-myc基因上調或增加導致凋亡減少，與腫瘤的發生、發展密切相關，下調或抑制該基因可能抑制腫瘤發生發展。

4參考文獻

1鄭元元,蔣軍廣,趙娜,等.γ-synuclein在非小細胞肺癌中的表達〔J〕.中國老年學雜志,2011；31(24):4771-3.

2劉瑞芬,蔣軍廣,張曉燕,等.凋亡相關基因bax在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(9):2002-3.

3李雪婷,李麗,李素紅,等.宮頸鱗癌中癌基因C-myc與相關蛋白E2F-1P15INK4b的表達及臨床意義的研究〔J〕.中國藥物與臨床,2013;13(2):162-5.

4趙文潔,楊帆,謝裕安,等.二階段化學誘發小鼠肝癌模型C-MYC基因動態變化的研究〔J〕.廣西醫學,2013;35(1):1-4.

5范平明,江朝娜.食管鱗狀細胞癌患者術后組織中MMP-14及C-MYC的表達及相關性〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(2):306-7.

6Hatakeyama S,Watanabe M,Fujii Y,etal.Targeted dest ruction of c-myc by an engineered U biquitin ligase suppreses cell transformation and tumor formation〔J〕.Cancer Res,2005;65(17):7874-9.

7項鋒鋼,黨受琴,冉雯雯,等.非小細胞肺癌組織Bmi-1與c-myc蛋白表達及其相關性〔J〕.青島大學醫學院學報,2011;47(3):204-6,209.

8Nakashima N,Liu D,Huang CL,etal.Wnt3 gene expression promotes tumor progression in non-small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer,2011;76(2):228-34.

9賴習華,王茂生,陳小萍,等.C-myc與PCNA在肺癌組織中的表達及其意義〔J〕.現代腫瘤醫學,2011;19(8):1583-5.

10王革平,陳莉.非小細胞肺癌中PGSK-3β、C-myc表達及臨床意義〔J〕.現代腫瘤醫學,2011;19(11):2224-6.

11簡麗萍,王鴻程,孔志斌,等.STAT5、cyclinD1和c-myc蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2007；23(12):1172-3.

12辛彩霞,左自立,王鴻程,等.STAT4、STAT6與c-myc在非小細胞肺癌組織中的表達及相關性〔J〕.腫瘤基礎與臨床,2011;24(4):280-3.

13趙云霞,龔曉萌,劉德純,等.BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的異常表達及臨床意義探討〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志,2012;21(1):57-62.

〔2014-02-14修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)