丹參酮ⅡA對大鼠血管平滑肌細胞BIP和CHOP表達的影響

丹參酮ⅡA對大鼠血管平滑肌細胞BIP和CHOP表達的影響

陳芳王 麗1沈曉君1王保奇1

(河南省人民醫院，河南鄭州450003)

摘要〔〕目的研究丹參酮ⅡA對同型半胱氨酸(HCY)誘導增殖血管平滑肌細胞(VSMC)內質網應激(ERS)相關基因免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP)和C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)表達的影響，探討丹參酮ⅡA促進HCY誘導增殖VSMC凋亡的相關機制。方法大鼠VSMC原代培養、鑒定，建立HCY誘導的細胞增殖模型，用不同濃度的丹參酮ⅡA干預，Annexin/PI雙染法檢測細胞凋亡率；實時熒光定量PCR檢測BIP和CHOP表達量。結果丹參酮ⅡA可促進VSMC凋亡，與HCY組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照組比較，HCY刺激使BIP和CHOP表達上調(P<0.05，P<0.01)；丹參酮ⅡA組劑量依賴性上調VSMC BIP表達，與HCY組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；與HCY組比較，0.5 mg/L丹參酮ⅡA處理對大鼠VSMC CHOP表達無明顯影響，而1 mg/L丹參酮ⅡA使CHOP表達上調(P<0.05，P<0.01)。結論丹參酮ⅡA可促進HCY誘導增殖的VSMC凋亡，凋亡過程由核轉錄因子CHOP介導，BIP基因可能是其作用靶點之一。

關鍵詞〔〕丹參酮ⅡA；同型半胱氨酸；血管平滑肌細胞；BIP；CHOP

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(112300410051)；鄭州市科技創新團隊資助項目(121PCXTD520)

通訊作者：沈曉君(1955-),女,教授,主要從事心血管疾病中醫藥防治研究。

1河南中醫學院

第一作者：陳芳(1986-)，女，博士，主治醫師，主要從事心血管病研究。

動脈粥樣硬化(AS)及其所導致的心腦血管疾病是當今人類死亡的首位原因,血管平滑肌細胞(VSMC)增殖是AS的主要形態特征，也是AS時內膜肌層和內皮損傷的重要標志，許多危險因素可以通過促進VSMC增殖等效應引起AS病變形成〔1〕。本實驗通過觀察丹參酮ⅡA對同型半胱氨酸(HCY)誘導增殖的大鼠VSMC內質網應激(ERS)相關基因免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP)和C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)表達的影響，探討丹參酮ⅡA促進HCY誘導增殖VSMC凋亡的機制和可能的作用靶點。

1材料與方法

1.1 材料丹參酮ⅡA對照品購自中國藥品生物制品鑒定所,20 mg/瓶,批號：200619。HCY，Sigma公司產品，25 g/瓶,純度≥98%，批號：C-7352。瑞舒伐他汀(可定)，阿斯利康制藥有限公司，國A2002002。二氧化碳(CO2)恒溫培養箱(德國Heraeus公司)；FACS Calibur 流式細胞儀(BD，USA公司產品)；FLUOVIEW FV100共聚焦熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；DMEM、胰蛋白酶(Gibco BRL. USA產品)；Ⅱ型膠原酶 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；逆轉錄試劑盒、實時定量試劑盒、總RNA提取試劑(均為日本Takara公司產品)；α-SMA抗體(武漢博士德公司產品)；PCR擴增儀(德國Whatman Biometra公司)；實時定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培養雄性Wistar大鼠購自湖北省動物實驗中心，體質量200~250 g，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速分離取出腹主動脈，小心剝除血管外膜，縱行剪開血管，PBS液洗2次，剪成0.5~2 mm大小的組織塊,放入含有1 mg/ml Ⅱ型膠原酶溶液的離心管中，37℃溫箱中消化30 min，劇烈震蕩離心管除去內皮細胞后將組織塊取出，放入新鮮的1 mg/ml Ⅱ型膠原酶溶液中，繼續37℃溫箱中消化4~6 h，待組織塊呈絮狀后終止消化。離心，去上清，重懸細胞，轉入培養瓶中。待細胞長至75%匯合度時，消化傳代，取2~5代的血管平滑肌細胞用于實驗。

1.2.2 免疫組織化學檢測細胞接種到6孔板中培養72 h后，去上清，PBS液洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，加入0.3%TritonX-100，倒掉后再加入TritonX-100室溫透化15 min，滴加30 μl血清封閉液(二抗宿主來源)室溫封閉30 min。加入一抗α-SMA抗體(1∶50)，4℃孵育過夜。加入FITC標記羊抗小鼠二抗(1∶100)，37℃孵育30 min，同時加4′，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(4′,6-diamino-2-phenylindole，DAPI)染細胞核，37℃孵育30 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞分組與藥物干預取生長狀態良好的細胞胰酶消化后制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/ml個。將處理好的蓋玻片放入6孔板各孔中，每孔準確接種900 μl細胞懸液，繼續培養后將細胞分為空白組、HCY組、瑞舒伐他汀(可定)組和丹參酮ⅡA組。除空白組外，各組均加入劑量為10-4mol/L同型半胱氨酸，培養24 h后，可定組加入終濃度10 μmol/L的可定，丹參酮ⅡA組分別加入終濃度0.5 mg/L、1 mg/L的丹參酮ⅡA，培養48 h后，收集細胞。

1.2.4 Annexin V-PI法檢測細胞凋亡率各組PBS液洗滌，0.125%胰蛋白酶消化，轉移至離心管中，加入培養液，混勻后1 000 r/min離心，棄上清，加PBS重懸細胞，調整細胞濃度為106/ml，取0.5 ml細胞懸液，1 000 r/min離心4 min，棄上清，加0.5 ml 上樣緩沖液重懸細胞，加入1 μl熒光標記的Annexin V試劑，混勻后避光室溫下孵育20 min，加入5 μl PI，混勻后避光4℃下孵育5 min，加入500 μl上樣緩沖液，隨即用流式細胞儀檢測凋亡率，使用Flow max 2.4軟件。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測BIP和CHOP mRNA表達引物設計：BIP序列引物，正義：5′-GTTCTGCTTGATGTGTGTCC-3′，反義：5′-TTTGGTCATTGGTGATGGTG-3′；CHOP序列引物，正義：5′-CGCCTTCAACGACGAGTTCCTG-3′，反義：5′-GCTGTTCTTATCCACCGACTTC-3′；β-actin引物設計，正義引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，反義：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。提取每組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。 PCR反應體系為10 μl：SYBR Green I Mixture 5 μl，正義引物0.25 μl，反義引物0.25 μl，模板cDNA 1 μl，ddH2O 3.3 μl，Rox 0.2 μl，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s；58℃退火40 s；72℃延伸40 s，共45個循環，每個樣本的RNA含量均根據各自的β-actin含量進行標準化，2-△△CT法分析BIP和CHOP相對表達量。

1.3 統計學方法應用SPSS10. 0軟件包進行單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD方法。

2結果

2.1 細胞培養及鑒定倒置相差顯微鏡觀察，細胞多呈長梭形、核大，細胞質呈現綠色，胞核呈藍色，可見明顯的肌絲纖維。免疫組化結果顯示，超過98%的細胞胞質內特異性標志蛋白α-SMA表達呈陽性，提示培養細胞為VSMC，見圖1。

圖1　大鼠VSMC原代細胞培養、鑒定(×100)

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結果丹參酮ⅡA、可定均可顯著促進VSMC凋亡，可定組(7.11±0.21)、0.5 mg/L丹參酮ⅡA組(5.22±0.31)、1 mg/L丹參酮ⅡA組(13.67±0.25)大鼠VSMC凋亡百分率與HCY組(0.09±0.17)相比，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。

2.3 丹參酮ⅡA對VSMC BIP和CHOP mRNA表達的影響實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組比較，HCY刺激使BIP和CHOP表達上調(P<0.01)；丹參酮ⅡA組和可定組VSMC BIP mRNA表達均升高，與HCY組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)，且丹參酮ⅡA上調VSMC BIP mRNA表達存在劑量依賴性；與HCY組比較，0.5 mg/L丹參酮ⅡA處理對大鼠VSMC CHOP mRNA表達無明顯影響，而1 mg/L丹參酮ⅡA和可定均使CHOP mRNA表達顯著升高 (P<0.01)。見表1。

表1　丹參酮ⅡA對VSMC BIP和CHOP mRNA

與對照組比較：1)P<0.01；與HCY組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

VSMC向血管內膜遷移、增殖是AS的主要病理特征之一，VSMC通過其表面的受體結合、攝取脂質轉變為肌源性泡沫細胞，與炎癥細胞、細胞外脂質及粥樣壞死組織等構成AS斑塊。遷移、增殖的VSMC不僅是AS斑塊的主要細胞成分，而且呈合成型改變的VSMC還可分泌大量的細胞因子和生長因子，刺激更多的VSMC遷移、增殖和細胞外基質蛋白形成，促進AS病變發生發展〔2，3〕。因此，抑制VSMC的過度增殖是延緩或逆轉AS病變的有效途徑。HCY是蛋氨酸在體內分解代謝的中間產物，大量的流行病學調查表明高HCY血癥是AS新的獨立危險因素。研究證實高HCY血癥致AS的作用與其促進VSMC增殖有關〔4〕。Zhang等〔5〕研究表明，HCY可通過內皮細胞中血小板源性生長因子DNA脫甲基作用而激活VSMC，促進其增殖。

BIP又稱葡萄糖調節蛋白78(GRP78)，是位于內質網上重要的分子伴侶，參與阻止內質網新生肽聚集、調節內質網鈣穩態以及啟動未折疊蛋白反應(UPR)等細胞生命過程。真核細胞的膜蛋白及分泌性蛋白質在內質網中合成后經翻譯后修飾、折疊和組裝，由高爾基體進一步加工后轉運到膜上或分泌到胞外。當各種因素作用下新生肽鏈的修飾折疊與組裝受到干擾，將引起未折疊蛋白在內質網中堆積，使細胞產生ERS，細胞經由上調內質網伴侶蛋白表達等相關機制啟動UPR，以降低蛋白合成速率，恢復細胞內環境穩定〔6〕。存在于內質網膜上的RNA依賴性蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)、轉錄激活因子6(ATF6)及需肌醇酶1(IRE1)是感受內質網內應激信號的一類跨膜感受蛋白。3種跨膜感應蛋白，常態下PERK、ATF6、IRE1分別與BIP結合形成復合物，處于無活性狀態。當ERS發生時，3種信號感受蛋白與BIP解離，BIP轉而與未折疊蛋白相結合，促進蛋白質正確折疊，在一定程度上減輕或消除內質網內蛋白質折疊功能的負荷，因此UPR是細胞的一種適應性保護機制。當ERS過于強烈持久，大量與BIP解離的PERK、ATF6、IRE1可誘導CHOP的轉錄，從而激活CHOP/GADD153細胞凋亡通路。CHOP是聯系ERS與細胞凋亡的重要中間信號分子，CHOP高表達可通過抑制凋亡負調節蛋白Bcl-2等多種途徑誘導細胞凋亡〔7〕。

丹參酮ⅡA是從丹參中提取出來的脂溶性有效成分之一，具有改善微循環，降壓，擴張冠狀動脈，抑制血小板聚集，抑制血管平滑肌細胞增殖，抗心肌肥厚等廣泛的藥理學作用，廣泛應用于心血管疾病的治療〔8〕。前期的研究發現，ERS可能是AS時VSMC增殖失控的機制之一，丹參酮ⅡA可通過ERS途徑干預兔AS病變〔9〕。本研究結果顯示，丹參酮ⅡA可促進大鼠VSMC凋亡，與HCY組比較差異顯著，進一步支持丹參酮ⅡA通過抑制VSMC增殖而發揮抗AS 作用的理論，ERS與丹參酮ⅡA誘導的細胞凋亡過程有關，丹參酮ⅡA誘導的VSMC凋亡過程由核轉錄因子CHOP介導。ERS信號轉導通路被認為是除死亡受體活化和線粒體損傷外又一條新的介導細胞凋亡信號傳導的通路，CHOP作為一種轉錄因子通過調節相關基因的表達決定細胞的生存與死亡。本實驗結果表明丹參酮ⅡA可上調內質網應激蛋白BIP基因表達使凋亡信號放大，通過CHOP轉錄激活誘導過度增殖的VSMC凋亡，但CHOP誘導凋亡的下游信號機制還需要進一步的深入研究。

4 參考文獻

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4Liu X,Shen J,Zhan R,etal.Proteomic analysis of homocysteine induced proliferation of cultured neonatal rat vascular smooth muscle cells〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009;1794(2):177-84.

5Zhang D,Chen Y,Xie X,etal.Homocysteine activates vascular smooth muscle cells by DNA demethylation of platelet-derived growth factor in endothelial cells〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2012;53(4):487-96.

6Chakrabarti A,Chen AW,Varner JD. A review of the mammalian unfolded protein response〔J〕.Biotechnol Bioeng,2011;108(12):2777-93.

7周雪瓊,賀凌飛,余日安.內質網應激及未折疊蛋白反應通路研究進展〔J〕.中國職業醫學,2012;39(3):264-7.

8楊征,邱敏.丹參酮ⅡA的心血管作用及機制研究進展〔J〕.中國動脈粥樣硬化雜志,2011;19(4):372-4.

9沈曉君,高愛社,關懷敏,等.丹參酮ⅡA對兔動脈粥樣硬化病灶凋亡相關基因表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(1):90-2.

〔2013-12-16修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)