腎上腺髓質素對大鼠肢體缺血再灌注后心肌損傷和細胞凋亡的影響

腎上腺髓質素對大鼠肢體缺血再灌注后心肌損傷和細胞凋亡的影響

(唐山職業技術學院基礎醫學部生理學教研室，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察大鼠肢體缺血再灌注后心肌細胞凋亡情況，探討外源性腎上腺髓質素(ADM)對大鼠肢體缺血再灌注(LIR)后心肌損傷的保護機制。方法健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分成對照組(Control組)、肢體缺血再灌注4 h組(LIR組)和ADM+ LIR組(ADM組)，每組10只。生化法檢測血漿心肌酶含量；比色法測定心肌組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化；免疫組織化學法檢測心肌組織凋亡蛋白酶Caspase-3蛋白表達情況；原位末端脫氧核糖核苷酸轉移酶標記(TUNEL)技術檢測心肌凋亡細胞。結果與LIR組比較，心肌酶含量下降，心肌組織MDA含量減少，SOD活性增強(P<0.01)；心肌組織Caspse-3蛋白表達下降，心肌細胞凋亡指數明顯下降(P<0.01)。結論ADM可減輕大鼠LIR后心肌損傷，其機制可能與抑制心肌氧化應激與細胞凋亡有關。

關鍵詞〔〕再灌注損傷；心肌；凋亡；腎上腺髓質素；氧化應激

中圖分類號〔〕R363〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：唐山市科學技術研究與發展項目(No.12130239b)

1唐山市開灤總醫院ICU

第一作者：朱娜(1977-),女，碩士，講師，主治醫師，主要從事肢體缺血再灌注損傷的防治及機制研究。

肢體缺血再灌注(LIR)可造成肢體以外遠隔器官損傷。再灌注后氧自由基和炎性因子大量生成，細胞過度凋亡等因素相互關聯，共同影響著遠隔器官的病理生理過程〔1，2〕。LIR后可造成心肌形態結構及代謝改變。尋找防治再灌注后損傷的有效藥物是近年熱點之一。腎上腺髓質素(ADM)是內源保護性調節肽，具有舒張阻力血管、抑制細胞凋亡、降低氧化應激等作用。文獻證實外源性應用可減輕心肌細胞死亡，改善心功能〔3〕。本實驗觀察外源性ADM對LIR大鼠心肌損傷及細胞凋亡的影響，探討ADM對心肌的保護作用。

1材料與方法

1.1 動物及分組由河北聯合大學醫學院動物實驗中心提供,健康成年雄性Wistar大鼠30只。實驗大鼠隨機分為對照組(Control組)、肢體缺血再灌注組(LIR 組)和ADM+ LIR組(ADM組)，每組10只。

1.2 試劑和儀器TUNEL試劑盒、Caspase-3一抗、即用型免疫組化試劑盒等購自北京中山生物制劑公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；ADM試劑由北京康肽生物有限公司提供。Nikon攝影生物光學顯微鏡：日本日立公司生產；Motic 醫學圖像分析系統：麥克奧迪儀器儀表有限公司；DF-205恒溫干燥箱：北京西城區醫療器械二廠。

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1.3 模型制備采用本室常規方法建立大鼠LIR模型，即用橡皮圈環繞結扎大鼠雙后肢根部，阻斷血流4 h后松解，恢復灌注4 h，于松解前15 min以20%烏拉坦腹腔注射麻醉，固定于解剖臺上，頸正中部切口分離左側頸外靜脈插管，注入肝素(1 000 U/kg)抗凝血。ADM組按模型操作，松解前15 min經頸外靜脈插管緩慢推注1.0 nmol/kg ADM生理鹽水溶液。Control組雙后肢松弛環繞橡皮圈，不阻斷血流，LIR組按模型操作，松解前15 min均通過頸外靜脈插管推注4 ml/kg生理鹽水。結扎時雙下肢皮膚蒼白，溫度降低觸之冰冷，松開止血帶，皮膚逐漸變紅，局部溫度升高，雙下肢腫脹。經激光多普勒血流儀檢測肢體血流情況證實模型成功。

1.4 標本采集與檢測

1.4.1 血清心肌酶測定從腹主動脈放血處死動物并收集血液，常溫離心后取血漿，HI-TACHI7200全自動生化分析儀測定肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.4.2 心肌組織氧化應激指標的測定取心肌組織加冷生理鹽水制備10%組織勻漿，離心10 min，收集上清液，比色法檢測心肌組織MDA和SOD含量。

1.4.3 心肌組織Caspase-3蛋白水平的測定 心臟經濾紙吸干血跡，取心尖部心室肌組織，4%多聚甲醛固定石蠟包埋切片，按免疫組化常規操作。細胞質呈棕黃色染色者為陽性細胞。采用Motic醫學圖像分析系統軟件對各組大鼠心肌組織切片進行分析，鏡下以相同外部條件攝取圖像，每張隨機選擇6個視野，取平均值。

1.4.4 TUNEL法心肌細胞凋亡的測定 檢測方法嚴格按說明書操作。細胞核呈棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞，計算6個高倍視野下的凋亡細胞數及凋亡指數(AI)。

1.5 統計學分析采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1各組大鼠血清心肌酶含量的變化LIR組與Control組比較，血漿CK和CK-MB含量均明顯升高(P<0.01)；給予ADM后，血漿CK和CK-MB含量較LIR組降低(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠血清CK和CK-MB

與Control組比較：1)P<0.01；與LIR組比較：2)P<0.01；下表同

2.2 各組大鼠心肌組織MDA和SOD含量的變化 LIR組與Control組比較，心肌組織MDA含量升高，SOD含量降低(P<0.01)；給予ADM后，MDA含量較LIR組明顯降低(P<0.01)，但仍高于Control組，SOD含量增高 (P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠心肌組織MDA和

2.3 各組大鼠心肌凋亡的情況變化TUNEL染色可見陽性細胞核呈棕黃色改變，形態不規整。Control未見TUNEL陽性細胞。心肌細胞Caspase-3免疫組化染色陽性細胞主要表現為,心肌細胞胞質或胞膜呈棕黃色顆粒或勻質狀。Control組呈弱陽性表達。LIR組與對照組比較，凋亡細胞增多，凋亡指數明顯升高，心肌細胞Caspase-3表達明顯上調(P<0.01)。ADM組與LIR組比較，凋亡細胞減少，凋亡指數明顯下降,心肌細胞Caspase-3表達明顯下調(P<0.01)，見表3，圖1、圖2。

表3　各組大鼠心肌組織Caspase-3表達和

圖1　各組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達(DAB,×100)

圖2　各組大鼠心肌細胞凋亡(TUNEL,×400)

3討論

LIR損傷是一種多因素綜合作用的復雜病理過程，再灌注后大量自由基的產生和細胞凋亡是造成肢體以外遠隔器官損傷發生的主要機制〔1〕。MDA是膜脂質過氧化的代謝終產物，其含量反映脂質過氧化程度并間接反映自由基的水平。SOD作為體內自由基的防御系統，能有效清除氧自由基。本研究表明肢體再灌注后大量氧自由基產生，造成膜脂過氧化，損傷生物膜，心肌酶漏出增多，與文獻報道的結果相符〔4〕，氧化應激是LIR后器官損傷的重要形式。氧自由基的大量生成除直接引發組織損傷破壞之外也可能作為凋亡誘導的主要因素之一〔5〕。

研究已證實活性氧可誘導細胞凋亡〔6〕。活性氧參與核轉錄因子的活化，被激活后轉位進入細胞核內，促進基因轉錄〔7〕；降低線粒體膜電位，調節信號轉導通路，引起細胞凋亡〔8，9〕。凋亡是由Caspase家族介導呈級聯化學反應的過程，調節機體細胞增殖與更新間的平衡，維持組織器官正常生理功能及細胞數量的穩定。凋亡是一種基本生理機制，Caspase-3是細胞凋亡發生的關鍵酶。但凋亡過度則可引起細胞損傷。本研究顯示再灌注后心肌細胞Caspase-3蛋白表達增強，細胞發生凋亡樣改變，凋亡細胞明顯增多。推測肢體缺血再灌注后自由基大量產生并誘導心肌細胞凋亡加劇，二者共同參與了LIR后心肌損傷過程。

ADM是從人類嗜鉻細胞瘤組織中提取的一種血管活性肽，具有多種生物學功能。研究發現〔10，11〕ADM可抑制細胞凋亡，ADM基因轉染可減少過氧化物的產生和密度，增加心肌cGMP水平提高Bcl-2水平，可通過抑制氧化應激減少細胞凋亡。本實驗觀察到再灌注前給予ADM進行干預，血漿中心肌酶漏出減少，心肌組織MDA含量降低，SOD活性升高，心肌細胞Caspase-3蛋白表達下降，凋亡細胞減少，提示ADM能夠通過降低心肌脂質過氧化反應，抑制氧化應激，從而減少心肌細胞凋亡。

綜上，LIR后給予ADM可減輕心肌損傷，這一效應可能通過改善心肌氧化應激狀態，抑制心肌細胞的過度凋亡有關。但具體細胞凋亡的相關蛋白及信號轉導通路尚需探討。

4參考文獻

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〔2013-12-13修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)