黃連素抑制人喉癌Hep-2細胞增殖及機制研究

黃連素抑制人喉癌Hep-2細胞增殖及機制研究

李蕾,丁小青,周建業,周衛東,湯夏冰*

(南京醫科大學附屬無錫人民醫院，江蘇 無錫 214023)

摘要：目的探討黃連素對人喉癌Hep-2細胞增殖的抑制作用及其可能機制。方法體外培養Hep-2細胞，使用不同濃度黃連素誘導不同時間，應用MTT法檢測細胞增殖抑制率；流式細胞術測定細胞周期及凋亡；實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡(Western blot)法分別檢測細胞周期蛋白D(CyclinD)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)基因和蛋白表達水平。結果與0 μmol/L黃連素對照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黃連素作用Hep-2細胞24、48 h，可明顯抑制細胞增殖，且呈濃度時間依賴性(P<0.05)；2.5、5.0、10.0 μmol/L黃連素作用 Hep-2細胞48 h，細胞早期凋亡率明顯升高，呈濃度依賴性(P<0.05)；G0/G1期細胞增多(P<0.05)，誘導細胞阻滯于G0/G1期；10μmol/L黃連素作用Hep-2細胞48 h，Bax基因和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，CyclinD、Bcl-2基因和蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。結論黃連素能抑制喉癌細胞增殖，引起G0/G1期阻滯，并誘導其凋亡，其作用機制可能與Bax基因表達上調及CyclinD、Bcl-2基因表達下調有關。

關鍵詞：黃連素；喉癌；細胞增殖

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.004

中圖分類號：R767文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2015)06-1109-03

基金項目:南京醫科大學科技發展基金(2013NJMU161, 2013NJMU167)。

作者簡介:李蕾(1986-)，女，碩士研究生，主要從事喉癌的基礎與臨床研究。

收稿日期:(2015-04-20)

*通信作者:湯夏冰，電話-15861598912,電子信箱-txbny@sina.com

Berberine on proliferation of human laryngeal Hep-2 carcinoma cells

LI Lei, DING Xiaoqing, ZHOU Jianye, ZHOU Weidong, TANG Xiabing*

(Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi 214023,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of berberine on proliferation of human laryngeal Hep-2 carcinoma cells and its possible mechanism. MethodsThe Hep-2 cells were treated with different concentrations of berberine for different hours, the proliferation inhibitory rates were detected by MTT assay; the cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry; the levels of CyclinD, Bcl-2 and Bax were measured by real-time PCR and Western blot. ResultsThe proliferation inhibition rates of Hep-2 cells treated with 2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L berberine for 24 and 48 hours were increased compared with 0μmol/L group in concentration-and time-dependent manners (P<0.05). The early apoptotic rate was increased in concentration-dependent manner (P<0.05), and the proportion of cells in G0/G1 phase was increased after treated with 2.5, 5.0, 10.0 μmol/L berberine for 48 hours (P<0.05). The levels of Bax mRNA and protein expression significantly increased (P<0.05), while the levels of CyclinD and Bcl-2 expression significantly decreased (P<0.05). ConclusionBerberine can inhibit proliferation, and induct cell cycle G0/G1 arrest and apoptosis of Hep-2 cells probably via upregulation of Bax and downregulation of CyclinD and Bcl-2 mRNA and protein expression.

Keywords:berberine; laryngeal carcinoma; cell proliferation

黃連素又稱小檗堿，屬于異喹啉類生物堿，是一種傳統的中醫消炎及抗菌藥物。研究[1-12]表明，黃連素在肝癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等多種腫瘤中有抗癌作用。但在喉癌發生、發展中的作用及調控機制尚未見報道。本研究以人喉癌Hep-2細胞作為研究對象，體外研究黃連素對Hep-2細胞增殖的影響及其可能機制，為黃連素的臨床應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料人喉癌細胞株Hep-2購自中國典型培養物保藏中心；MEM培養液購自Hyclone公司；黃連素、MTT購自Sigma公司；細胞周期、Annexin V-FITC、細胞凋亡檢測試劑盒、蛋白質免疫印跡(Western blot)相關試劑購自碧云天公司；Trizol、逆轉錄試劑盒PrimeScript RT及實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司，細胞周期蛋白D(CyclinD)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) PCR引物由TaKaRa公司合成。1.2細胞培養人喉癌細胞株Hep-2使用含10% FBS MEM培養液，在37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。1.3MTT法分析取對數生長期的Hep-2細胞按每孔5×103個接種于96孔板中培養,培養24 h后，加入不同濃度2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黃連素的完全培養液200 μL，每組藥物濃度設3個復孔，同時設不加黃連素的對照組(含0.1% DMSO完全培養液)和不接種細胞的空白孔，分別培養24、48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫下振蕩10 min，使產生的結晶紫完全溶解。在酶標儀上于490 nm波長處測定各孔的光密度值(OD值)。以空白孔調零。細胞增殖抑制率=[1-OD(實驗組)/OD(對照組)]×100%。1.4細胞周期測定取對數生長期的Hep-2細胞接種于6孔板中培養，24 h后加入無血清MEM培養液培養24 h，使之同步化，然后加入不同濃度2.5、5.0、10.0 μmol/L黃連素的完全培養液培養48 h后，經胰酶消化，吹勻的細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，用預冷的PBS洗滌細胞1次，加入預冷70%乙醇固定細胞，輕輕吹勻，4 ℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞,用預冷的PBS洗滌細胞，每管細胞樣品中加入0.5 mL按說明書配制的碘化丙啶(PI)染色液，重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。用流式細胞儀檢測，采用適當分析軟件進行細胞周期分析。以不加黃連素的細胞作為對照組。1.5細胞早期凋亡測定分組同細胞周期測定，培養48 h后，收集細胞培養液，用PBS洗滌細胞，經胰酶消化，吹勻細胞的細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，用PBS重懸細胞，取10萬重懸的細胞，1 000 r/min離心5 min，加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，混勻。室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，加入190 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞。加入10 μL PI染色液，混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。以不加黃連素的細胞作為對照組。1.6CyclinD、Bax、Bcl-2 mRNA水平檢測采用Real-time CR法檢測。按照 Trizol說明書提取10.0 μmol/L黃連素作用后48 h細胞總RNA。根據Prime Script RT reagent Kit試劑盒說明書進行逆轉錄反應。CyclinD上游引物為5’- CACGGCTCACGCTTACCTCA-3’，下游引物為5’-ACTTGCGCGTCACAGGACAG-3’； Bax上游引物為5’- TGCGTCCACCAAGAAGCTGA-3’，下游引物為5’-AACATGTCAGCTGCCACTCG-3’； Bcl-2上游引物為5’- CTTCAGAGACAGCCAGGAGA-3’，下游引物為5’-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3’；GAPDH上游引物為5’-AACGGATTTGGTCGTATTG- 3’，下游引物為5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。以2-△△Ct表示各組 mRNA相對量。以不加黃連素的細胞作為對照組。1.7CyclinD、Bax、Bcl-2 蛋白水平檢測采用Western blot法檢測。用RIPA細胞裂解液裂解10.0 μmol/L黃連素作用后48 h細胞總蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，根據Marker位置剪膜，分別加入兔抗人CyclinD、Bcl-2、Bax多克隆抗體、兔抗人β-actin 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶HRP標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化學發光顯色，膠片顯影, 掃描膠片后用凝膠圖像分析系統測光密度值。蛋白相對表達水平是各組光密度值與相應β-actin光密度值的比值。以不加黃連素的細胞作為對照組。1.8統計學方法應用SPSS 18.0統計軟件分析，數據以均數±標準差(±s)表示，2組間比較采用雙側t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1黃連素對Hep-2細胞增殖的影響與0 μmol/L黃連素的對照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黃連素作用24、48 h對Hep-2細胞的增殖抑制率均明顯升高(P<0.05)，隨著時間的延長，不同濃度黃連素的增殖抑制率逐漸增強(P<0.05)，黃連素抑制Hep-2細胞增殖呈濃度時間依賴性。2.2黃連素對Hep-2細胞周期和細胞早期凋亡的影響2.5、5.0、10.0 μmol/L黃連素作用Hep-2細胞48 h，與0 μmol/L黃連素的對照組比較，隨著黃連素濃度的增加，G0/G1期細胞增多(P<0.05)，細胞阻滯于G0/G1期。 2.5、5.0、10.0μmol/L黃連素作用Hep-2細胞48 h，細胞的早期凋亡率分別為(1.73±0.15)%、(6.27±0.15)%、(13.2±0.20)%，與0 μmol/L黃連素的對照組(0.83±0.06)%比較，Hep-2細胞的早期凋亡率明顯升高(P<0.05)，呈濃度依賴性(P<0.05)。2.3黃連素對Hep-2細胞CyclinD、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達的影響與0 μmol/L黃連素的對照組比較，10 μmol/L的黃連素作用48 h，Bax mRNA和蛋白表達量明顯增加(P<0.05)。CyclinD、Bcl-2 mRNA和蛋白表達量明顯減少(P<0.05),見表1。

表1　黃連素對Hep-2細胞Cyclin D、Bcl-2、Bax mRNA 表達的影響( ± s)

表1　黃連素對Hep-2細胞Cyclin D、Bcl-2、Bax mRNA 表達的影響( ± s)

組 別CyclinDBcl-2Bax10μmol/L黃連素組0.49±0.02#0.71±0.02#1.65±0.10#對照組 1.00±0.05 1.00±0.06 1.00±0.05

注：與對照組比較，#P<0.05

3討論

本研究顯示，黃連素對人喉癌Hep-2細胞增殖有明顯抑制作用，呈濃度時間依賴性。黃連素能影響Hep-2細胞內DNA的復制和合成，抑制細胞的正常分裂，抑制細胞進入S期，從而使Hep-2細胞阻滯于G0/G1期，抑制腫瘤細胞的增殖。黃連素作用Hep-2細胞的早期凋亡率也升高，且呈濃度依賴性，說明黃連素可通過細胞促進周期阻滯和抑制凋亡從而抑制細胞的增殖。黃連素抑制腫瘤細胞增殖的機制可見相關報道[13-15]。 Bcl-2家族在細胞凋亡中起著重要作用。Bcl-2主要通過與Bax形成二聚體發揮作用，二者的比例決定細胞發生凋亡與否。CyclinD是調控細胞由G1期進入S期，促進分裂增殖的關鍵周期蛋白，其檢測出來的含量能初步反映整個細胞群的增殖活躍的程度。筆者通過對黃連素抑制喉癌細胞增殖機制的研究，發現黃連素上調了促凋亡蛋白Bax的基因和蛋白水平，下調了周期蛋白CyclinD、抗凋亡蛋白Bcl-2的基因和蛋白水平。 綜上所述，黃連素作為一種天然的中藥提取物，對喉癌Hep-2細胞增殖有抑制作用，其機制可能與誘導細胞G1期阻滯，上調Bax蛋白表達，下調Bcl-2及CyclinD蛋白表達，從而促進凋亡有關。黃連素對喉癌細胞的抑制作用可能還體現在遷移、侵襲等方面，有待進一步研究中。黃連素有望成為治療喉癌的有效化療藥物。

參考文獻：

[1]HU Yangyang, WANG Shengeng, WU Xu, et al. Chinese herbal medicine-derived compounds for cancer therapy: a focus on hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 149(3): 601-612.

[2]YANG Xiaolong, HUANG Ning.Berberine induces selective apoptosis through the AMPK mediated mitochondrial/caspase pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Molecular Medicine Reports, 2013, 8(2): 505-510.

[3]PAZHANG Y, AHMADIAN S, JAVADIFAR N, et al. COX-2 and survivin reduction May play a role in berberine-induced apoptosis in human ductal breast epithelial tumor cell line[J]. Tumour Biology : the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 2012, 33(1): 207-214.

[5]CAI Yuchen,XIA Qing, LUO Rongzhen,et al. Berberine inhibits the growth of human colorectal adenocarcinoma in vitro and in vivo[J]. Journal of Natural Medicines, 2014, 68(1): 53-62.

[6]WANG Lihong,CAO Hailong, LU n, et al. Berberine inhibits proliferation and down-regulates epidermal growth factor receptor through activation of Cbl in colon tumor cells[J]. PLOS One, 2013, 8(2): e56666.

[7]HO Y T, LU CHICHENG,YANG J S, et al. Berberine induced apoptosis via promoting the expression of caspase-8, -9 and -3, apoptosis-inducing factor and endonuclease G in SCC-4 human tongue squamous carcinoma cancer cells[J]. Anticancer Research, 2009, 29(10): 4063-4070.

[8]TSANG C M, CHEUNG K C, CHEUNG Y C, et al. Berberine suppresses Id-1 expression and inhibits the growth and development of lung metastases in hepatocellular carcinoma[J]. Biochimica et Biophysica acta, 2015, 1852(3): 541-551.

[9]LIU BING, WANG GENSHU, YANG JIE, et al. Berberine inhibits human hepatoma cell invasion without cytotoxicity in healthy hepatocytes[J]. PLOS One, 2011, 6(6): e21416.

[10]HO Y T, YANG J S, LI T C, et al. Berberine suppresses in vitro migration and invasion of human SCC-4 tongue squamous cancer cells through the inhibitions of FAK, IKK, NF-kappaB, u-PA and MMP-2 and -9[J]. Cancer Letters, 2009, 279(2): 155-162.

[11]ZHANG CHI, YANG XI, ZHANG QU, et al. Berberine radiosensitizes human nasopharyngeal carcinoma by suppressing hypoxia-inducible factor-1α expression[J]. Acta Oto-Laryngologica, 2014, 134(2): 185-192.

[12]YANG XI, YANG BAIXIA, CAI JING, et al. Berberine enhances radiosensitivity of esophageal squamous cancer by targeting HIF-1α in vitro and in vivo[J]. Cancer Biology & Therapy, 2013, 14(11): 1068-1073.

[13]HE WEI, WANG BIN, ZHUANG YUN, et al. Berberine inhibits growth and induces G1 arrest and apoptosis in human cholangiocarcinoma QBC939 cells[J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2012, 119(4): 341-348.

[14]YAN KEQING, ZHANG CHENG, FENG JINBO, et al. Induction of G1 cell cycle arrest and apoptosis by berberine in bladder cancer cells[J]. European Journal of Pharmacology, 2011, 661(1/3): 1-7.

[15]FU LINGYI, CHEN WANGBING, GUO WEI, et al. Berberine targets AP-2/hTERT, NF-κB/COX-2, HIF-1α/VEGF and cytochrome-c/caspase signaling to suppress human cancer cell growth[J]. PLOS One, 2013, 8(7): e69240.