市售新疆紫草藥材的質量考察

市售新疆紫草藥材的質量考察

買爾旦·馬合木提1， 馬冉2， 古麗仙·胡加1

(1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院, 烏魯木齊830011；2天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室(北京大學)， 北京100191)

摘要：目的考察新疆部分地區市場銷售的新疆紫草藥材的質量。方法收集新疆不同地區市場上銷售的新疆紫草藥材10批，采用紫外分光光度法(藥典法)測定羥基萘醌總色素含量，反相高效液相色譜法測定紫草中左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素的含量。色譜條件：色譜柱Scienhome Kromasil C18(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.3%磷酸，采用梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢驗波長274，洗脫時間50 min。結果紫外分光光度法測得10批藥材中羥基萘醌總色素含量為0.60～17.30 mg/g，高效液相色譜法測得左旋紫草素的含量為0.01～0.96 mg/g,乙酰紫草素含量為0.39～24.10 mg/g，去氧紫草素含量為0.77～31.10 mg/g，β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素含量為0.25～13.20 mg/g。結論新疆市場流通的新疆紫草藥材羥基萘醌總色素及各成分含量差異很大。

關鍵詞：新疆紫草； 高效液相色譜； 紫外分光光度法

中圖分類號：R914文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.015

[收稿日期：2014-03-03]

Investigation on quality of Arnebia euchroma(Royle) Johnst

in Xinjiang medicinal materials markets

Maierdan Mahemuti1, MA Ran2, Gulixian Hujia1

(1AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2StakeKeyLaboratory

ofNaturalandBiomimeticDrugs,PekingUniversity,Beijing100191,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the quality of Arnebia euchroma(Royle) Johnst circulated in parts of Xingjian medicinal materials markets. MethodsTen batches of crude materials of Arnebia euchroma (Royle) Johnst in different regions of Xinjiang were collected for the total contents measurement of hydroxynaphthoquinones by UV spectrophotometry and contents measurement of four major naphthoquinones: shikonin, acetylshikonin, deoxy shikonin and β, β′-dimethylacryl shikonin by Re-HPLC simultaneously with the chromatographic conditions, in which the Scienhome Kromasil C18 column (4.6 mm×200 mm, 5 μm), acetonitrile -0.3% phosphoric acid were used as mobile phase by gradient eluting, at 35℃ with the flow rate of 1.0 mL/min for 50 min, detecting at 274 nm. ResultsThe total contents of hydroxynaphthoquinones in different samples were 0.6-17.3 mg/g by UV spectrophotometry, the content of shikonin, acetylshikonin, deoxy shikonin and β，β′-dimethylacryl shikonin were 0.01-0.96 mg/g, 0.39-24.1 mg/g, 0.77-31.1 mg/g and 0.25-13.2 mg/g, respectively. ConclusionThere were great differences in contents of total hydroxyl naphthoquinone and four major naphthoquinones in Arnebia euchroma (Royle) Johnst circulated in different parts of Xinjiang.

Key words：Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst； HPLC； UV Spectrophotometry

紫草為紫草科 (Boraginaceae) 多年生草本植物 , 其主要有效成分為紫草素 (shikonin), 產于新疆等地的紫草為軟紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst][1],其主要有效成分為阿卡寧 (alkannin),為紫草素的對映異構體[2]。中醫中藥認為紫草味苦、性寒 , 有涼血、 活血、解毒和透疹等功能,長期用于瘡瘍、淋濁、熱癥等, 其為《中華人民共和國藥典》收載的臨床常用中藥[3]。紫草素及其衍生物作為紫草的主要有效成分,已經被證實具有抗腫瘤[4]、抗炎[5]、止血[6]、保肝護肝等[7]多種藥理活性。紫草的化學成分包括紫草萘醌類、酚酸類、生物堿類、苯酚及苯醌類、三萜酸及甾醇類、黃酮類以及多糖類等物質[8]。對其研究較多的成分主要集中在萘醌類,包括紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素(β，β′-dimethylacryl shikonin)、去氧紫草素(Deoxy Shikonin)等[8]。我們在研究工作中發現，標示為新疆紫草的不同批號及不同來源的新疆紫草藥材樣品的實驗結果有常有一定的差異，造成這些差異的原因可能與所用的新疆紫草藥材的質量差異有關。因此本研究分別采用紫外分光光度法(藥典法)和HPLC法測定購買于新疆不同地區的新疆紫草中總萘醌及4種主要萘醌類成分紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)，β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素(β，β′-dimethylacryl shikonin)、去氧紫草素(Deoxy Shikonin)的含量，為科學評價新疆紫草藥材質量提供參考依據。

1材料與方法

1.1儀器與試藥儀器：Waters 2487型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，島津C18色譜柱(日本島津公司)，HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)，N-1001型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)，真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HH-S4數顯恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)，多功能電子天平(DT-200型)，紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，薄層色譜數碼成像系統(Cama-greprostar3),半自動點樣儀(Caamglinomat5)。試藥：新疆紫草對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121430-201103)，新疆紫草，經新疆醫科大學藥學院天然藥物化學/生藥學教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為紫草屬植物新疆紫草[Arnebeiaeuchroma (Royle) Johnst]，具體來源見表1。所有樣品經粉碎后，過篩(10目篩)備用。左旋紫草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110769-200405)，乙酰紫草素對照品(德瑞試劑公司，批號：20130507-2)，去氧紫草素對照品(德瑞試劑公司，批號：20130513-3)，β，β′-二甲基丙烯酰紫草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111689-200503)，硅膠板G(青島海洋化工廠)，水為蒸餾水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

表1　新疆紫草樣品來源

1.2方法

1.2.1供試品的制備

1.2.1.1對照品溶液分別精密稱取左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素標準品適量，置10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解后，制成每1 mL含1 mg的對照品貯備液，備用。量取各貯備液適量于同一5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，配制成含左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素分別為0.028、0.4、6、0.4 mg/mL的混合對照品溶液。

1.2.1.2紫草對照藥材供試品稱取對照藥材新疆紫草粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入95%乙醇12 mL，避光處理，冷浸提取8 h后，過濾，取濾液干燥箱干燥，揮干溶劑，再加入5 mL甲醇，超聲溶解，作為對照藥材溶液。

1.2.1.3樣品溶液分別稱取10批藥材樣品粉末適量，精密稱取1.0 g，同上處理，作為藥材樣品。

1.2.2薄層色譜鑒別分別取上述對照品溶液、對照藥材溶液、樣品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.5∶0.1)為展開劑展開，取出，晾干。紫外光燈(366 nm)檢視。

1.2.3HPLC色譜鑒別分別取上述對照品溶液、對照藥材溶液和各樣品溶液適量，甲醇稀釋，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，按以下色譜條件進樣10 μL，測定HPLC圖譜。

1.2.4總萘醌的含量測定取上述供試品溶液，依照《中國藥典》(2010版)萘醌的含量測定方法，照紫外-可見光光度法，在516 nm波長處測定吸光度，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸光系數為242 nm，計算即得。

1.2.5HPLC法測定總萘醌各組分的含量

1.2.5.1色譜條件色譜柱為Scienhome Kromasil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)及預柱，流動相為乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫過程(A梯度)0～10 min 70%，10～30 min 70%～75%，30～31 min 75%～95%，31～36 min 95%，36～37 min 95%～70%，37～50 min 70%。檢測波長274 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，理論板數計不低于3 000。

1.2.5.2標準曲線的制備分別精密量取左旋紫草素(2.8 μg/mL)、乙酰紫草素(400 μg/mL)、去氧紫草素(6 000 μg/mL)和 β， β′-二甲基丙烯酰紫草素(400 μg/mL)標準品溶液適量，分別用甲醇倍量稀釋，制成系列濃度，微孔濾膜過濾，照色譜條件進樣10 μL。以峰面積積分值(Y)對濃度(X)進行線性回歸。

1.2.5.3精密度試驗分別量取左旋紫草素(0.7 μg/mL)、乙酰紫草素(100 μg/mL)、去氧紫草素(1 500 μg/mL)和β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素(100 μg/mL)的標準品溶液，分別于1 d內連續進樣 6 次，計算日內精密度；取同一濃度的各溶液，連續測3 d ，計算日間精密度。

1.2.5.4重現性試驗稱取新疆紫草藥材樣品(S4，下同)6 份，按供試品溶液制備項下方法平行制備樣品溶液6份，分別測定，計算含量的RSD值。

1.2.5.5穩定性試驗取藥材樣品溶液1份，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣測定，計算RSD值。

1.2.5.6加樣回收率試驗取已知含量的藥材樣品溶液3份，分別加入高、中、低濃度的對照品混合溶液，依法測定，計算各組分的加樣回收率。

1.2.6紫草藥材中各組分的含量測定分別取各藥材粗粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇12 mL，避光處理，冷浸提取8 h,濾過，濾液濃縮揮干，精密加入5 mL甲醇，超聲溶解，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，按前述色譜條件進樣10 μL分析。

2結果

2.1薄層色譜鑒別藥材各樣品色譜圖中，在與標準品和對照品藥材色譜圖相應的位置，顯現相同的顏色的斑點。左旋紫草素比移值為0.27，乙酰紫草素比移值為0.38，去氧紫草素比移值為0.21,β，β′-二甲基丙烯酰紫草素比移值為0.50 ，見圖1。

2.2HPLC色譜鑒別對照品、對照藥材及藥材樣品的HPLC圖譜見圖2～4。

1-標準品混合溶液(從原點起依次為去氧紫草素，左旋紫草素，乙酰紫草素和β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素)，2- S1，3- S2，4- S3，5- S4，6- S5-,7- S6,8- S7,9-S8，10- S9,11- S10,12-對照藥材

圖1新疆紫草對照藥材及樣品的TLC色譜圖

1: 左旋紫草素； 2：乙酰紫草素; 3： 去氧紫草素； 4： β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素

圖2對照品HPLC色譜圖

1: 左旋紫草素; 2: 乙酰紫草素; 3: 去氧紫草素; 4: β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素

圖3對照藥材HPLC圖譜

1: 左旋紫草素； 2: 乙酰紫草素； 3: 去氧紫草素； 4: β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素

圖4藥材樣品HPLC圖譜

由以上圖譜可看出，對照品、對照藥材和藥材樣品在本色譜條件下各主要色譜峰的保留時間相同，說明樣品的主要成分與對照藥材一致。

2.3總萘醌的含量10批新疆紫草羥基萘醌總色素含量差異較大，與藥典規定的萘醌總色素以左旋紫草素(C16H16O5)計，不得少于0.80%的標準相比，有1個批樣品的含量偏低。藥材各樣品中總萘醌含量見表2。

表2　不同來源紫草藥材總萘醌含量( ±s)

2.4HPLC法測定總萘醌各組分的含量

2.4.1標準曲線的制備 左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素和 β， β′-二甲基丙烯酰紫草素的線性范圍及標準曲線見表3。

2.4.2精密度試驗左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素和β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素日內和日間RSD值分別為0.9%、1.2%、0.6%、1.6%及 0.8%、0.6%、0.5%、1.2%，符合要求。

2.4.3重現性試驗結果左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素，β，β′-二甲基丙烯酰紫草素含量的RSD值分別為1.4%、1.6%、1.9%和1.1%，符合要求。

2.4.4穩定性試驗左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素和 β，β′-二甲基丙烯酰紫草素在不同時間點的 RSD 值分別為1.6 %，1.4%，1.9%，1.3%,表明供試品溶液在24 h穩定。

2.4.5加樣回收率各組分加樣回收率見表4。

2.4.6紫草藥材中各組分的含量測定10批新疆紫草中4種主要成分的含量差異較大，左旋紫草素的含量為0.01～0.96 mg/g,乙酰紫草素含量為0.39～24.1 mg/g，去氧紫草素含量為0.77～31.1 mg/g，β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素含量為0.25～13.2 mg/g，結果見表5。

表3　標準曲線及線性范圍

表4　加樣回收率

注: 各組分加樣回收率均>95%，說明該方法準確。

3討論

中藥的質量控制是保證中藥的安全、有效、質量穩定可靠的必要條件。采用經典的單一成分定量分析藥材的質量的優劣，缺乏科學性和全面性。本研究采用紫外分光光度法和HPLC法分別測定了購于新疆部分地區市場流通的10批新疆紫草中總萘醌和左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素及β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素4種成分的含量，以了解評價新疆市場流通的紫草的質量情況。結果顯示，10批新疆紫草羥基萘醌總色素及4種主要成分的總含量差異較大。藥典法測得萘醌總色素的含量為0.6～17.3 mg/g，與藥典規定的萘醌總色素以左旋紫草素(C16H16O5)計，不得少于0.80%的標準相比，有1個批樣品的含量不符合要求。含量大小順序為S3(哈密)>S8(甘肅)>S2(阿勒泰)>S1(喀什市)>S4(烏市)>S5(烏市)>S6(福海)>S7(北屯)>S9(阿克蘇拜城)>S10(石河子)。其中S1(喀什市)、S2(阿勒泰)、S3(哈密)和S8(甘肅)的含量較為接近，S4(烏市)、S5(烏市)、S6(福海)、S7(北屯)和S9(阿克蘇拜城)接近。

HPLC法測得4種成分的結果顯示，左旋紫草素的含量為0.01～0.96 mg/g,除S7(北屯)較高外，其余樣品的含量基本接近。乙酰紫草素的含量為0.39～24.1 mg/g，其中S1(喀什市)、S4(烏市)、S5(烏市)、S6(福海)較接近，S2(阿勒泰)、S3(哈密)、S9(阿克蘇拜城)、S10(石河子)較接近，S7(北屯)和S8(甘肅)較接近。去氧紫草素的含量為0.77～31.1 mg/g，其中S1(喀什市)、S2(阿勒泰)、S3(哈密)、S4(烏市)、S5(烏市)S7(北屯)和S9(阿克蘇拜城)接近，S8(甘肅)和S10(石河子)較接近。β，β′- 二甲基丙烯酰紫草素的含量為0.25～13.2 mg/g，除S3(哈密)和S10(石河子)的含量較低以外，其余樣品的含量均接近。另外藥典規定HPLC法測定β，β′-二甲基丙烯酰紫草素(C21H22O6)的含量不得少于0.30%，因該法與本實驗采用的色譜條件和樣品的前處理方法不同，其結果無可比性。本研究結果說明市場流通的新疆紫草各成分含量差異很大。造成這種差異的因素復雜，與藥材種植及生長環境、采收時間、生長年限、采收過程、加工炮制、儲藏保管、包裝、檢測標準等一系列因素有關。因此，按照GAP標準，健全和完善從種植到加工炮制的全過程，同時提高紫草藥材的質量評價標準，對保證藥材的安全、有效、質量穩定具有現實意義。

(致謝:本論文得到天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室開放基金資助)(Supported by the State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs)

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(本文編輯施洋)