國產日本當藥中獐牙菜苦苷與當藥苷的HPLC含量測定及其品質評價

國產日本當藥中獐牙菜苦苷與當藥苷的HPLC含量測定及其品質評價

余小磊1，盧燕2，黃慶3，陳道峰2

(1.江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004；2.復旦大學藥學院生藥學教研室，上海 201203；

3.日本富基株式會社，日本 神戶 6580032)

摘要：目的建立一種可以同時測定日本當藥中獐牙菜苦苷與當藥苷的方法，對我國引種與日本產的日本當藥進行品質評價和比較。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水，梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長分別為238、247 nm。結果獐牙菜苦苷、當藥苷分別在0.019～1.234 mg·mL-1(r=1)、0.002～0.232 mg·mL-1(r=0.999 8)內呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為99.50%、99.90%，RSD值分別為1.58%、2.10%。我國引種日本當藥與日本產樣品相比，個別成分相對含量略有差異，其中獐牙菜苦苷含量較高，達到了97.21 mg·g-1，而當藥苷含量則較低；不同產地的日本當藥均以花中有效成分含量最高。結論我國引種的日本當藥中的獐牙菜苦苷含量高，很有開發價值，該文所建方法為我國對國產日本當藥的合理開發利用和質量控制提供了依據和技術。

關鍵詞：日本當藥；高效液相色譜；獐牙菜苦苷；當藥苷；品質評價

基金項目：科技部“重大新藥創制”重大科技專項課題(No.2009ZX09301-011)

作者簡介：余小磊，女，研究方向：中藥分析，E-mail:303628094@qq.com

通訊作者：盧燕，女，博士研究生，副教授，碩士生導師，研究方向：中草藥活性成分與質量控制，Tel：021-51980157，E-mail：luyan@fudan.edu.cn

中圖分類號：R284文獻標識碼：A

Determination of swertiamarin and chiratin inSwertiajaponicaby HPLC and its quality evaluation

YUXiao-lei1，LUYan2，HUANGQing3，CHENDao-feng2

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences，JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang

330004，China;2.DepartmentofPharmacognosy，SchoolofPharmacy，FudanUniversity，Shanghai

201203，China;3.JapanTomimotoCo.，Ltd.，Kobe6580032，Japan)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of swertiamarin and chiratin in Swertia japonica，as well as to evaluate the quality of S.japonica samples from China and Japan.MethodsThe determination method was developed on Phenomenex C18 column，eluting by a mixture of acetonitrile and water in gradient.The detector was set at 238 nm for swertiamarin and 247 nm for chiratin.ResultsThe line ranges of swertianmarin and chiratin were 0.019～1.234 mg·mL-1(r=1) and 0.002～0.232 mg·mL-1(r=0.999 8)，respectively.The average recoveries were 99.50% (RSD=1.58%) and 99.90%(RSD=2.10%)，respectively.The HPLC chromatograms of S.japonica samples from Japan and China were similar except for the relative height of some peaks.Compared with samples from Japan，S.japonica cultivated in China contained more swertiamarin and less chiratin.Both swertiamarin and chiratin were present with high content in flowers of S.japonica.ConclusionS.japonica was rich with swertiamarin as a potential medicinal resource.The quantitative method can be used in the development and quality control of S.japonica in China.

Key words:Swertiajaponica;HPLC;Swertiamarin;Chiratin;Quality evaluation

日本當藥是龍膽科獐牙菜屬植物SwertiajaponicaMakino的全草，性寒、味苦，歸肝、腎、大腸經，具有消濕熱、健胃及抗膽堿的功效[1]，主要分布在日本、朝鮮[2]。據文獻報道，日本當藥的粗提物對于胃損傷及結腸癌有一定的修復及預防作用[2,3]，在日本，主要作為苦味健胃劑來使用[2]，是一種很有開發價值的藥用資源。日本當藥中富含環烯醚萜類、三萜類和黃酮類化合物，其中環烯醚萜類成分獐牙菜苦苷及當藥苷具有多種生物活性，包括保肝、抗膽堿、鎮痛鎮靜和護膚護發作用等[4～7]，但現版日本藥局方的Swertiae Herba標準中僅測定獐牙菜苦苷的含量[8]。我國的當藥來源于同屬植物瘤毛獐牙菜(S.pseudochinensisHara.)的全草，也具有清濕熱、健胃的功效，其質量控制方法以獐牙菜苦苷和當藥苷作為指標成分[9～12]。目前日本當藥已在我國浙江引種，但尚未建立相關的質量標準。為了評價國產日本當藥的質量，并比較日本當藥與我國傳統當藥的差異，本研究在文獻方法基礎上，建立了高效液相色譜(HPLC)法同時測定日本當藥中獐牙菜苦苷和當藥苷兩種活性成分的含量，對日本當藥不同批次、不同產地及不同部位的樣品進行了分析，并對日本當藥與當藥進行了比較，以期為日本當藥在我國的成功引種及資源開發利用提供科學依據。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent HP1200型高效液相色譜儀；AB135-S天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；US10300AH超聲波清洗器(北京優晟聯合科技有限公司)；DIY-200C型中藥粉碎機(上海比朗儀器有限公司)。

1.2試藥當藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111742-200501)；獐牙菜苦苷(自制，經質譜、氫譜和碳譜確證結構，純度大于98%)；4批日本當藥藥材中有2批為日本原產樣品，2批為中國浙江引種樣品，經復旦大學藥學院陳道峰教授鑒定均為SwertiajaponicaMakino的全草，標本存放于復旦大學藥學院生藥學教研室，6批當藥樣品為市場上不同產地的藥材，經陳道峰教授初步鑒定為獐牙菜屬植物的全草，具體品種有待進一步鑒定；乙腈(國藥集團化學有限公司，色譜純)；水(杭州娃哈哈集團有限公司，去離子水)；其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Phenomenex C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(0～10 min，13%～13%;10～12 min，13%～20%;12～35 min，20%～50%;35～38 min，50%～100%;38～50 min，100%～100%)；流速：1 mL·min-1；獐牙菜苦苷檢測波長為238 nm，當藥苷檢測波長為247 nm；柱溫：30 ℃。在上述色譜條件下，獐牙菜苦苷和當藥苷對應的保留時間分別為7.9 min和11.8 min，分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1　HPLC色譜圖(247 nm) A.混合對照品;B.日本產日本當藥;C.國產日本當藥;D.當藥 1.獐牙菜苦苷；2.當藥苷

2.2對照品溶液的制備分別精密稱定對照品獐牙菜苦苷6.17 mg和當藥苷1.16 mg，分別置5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(濃度分別為1.234 mg·mL-1和0.232 mg·mL-1)。

2.3供試品溶液的制備取日本當藥或當藥藥材粉末(過3號篩)約0.1 g，精密稱定，置三角燒瓶中，用移液管精密移取10 mL甲醇于三角燒瓶中，稱重，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，稱重，用甲醇補足所失重量，搖勻，過濾，所得濾液作為供試品溶液。

2.4線性關系考察將獐牙菜苦苷儲備液依次稀釋至2、4、8、16、32、64倍，精密吸取上述稀釋液及儲備液各10 μL注入高效液相色譜儀，以峰面積Y對進樣濃度X求得回歸方程為Y=13 154X-25.541(r=1)；將當藥苷儲備液依次稀釋2、4、8、16、32、64、128倍，精密吸取上述稀釋液及儲備液各10 μL注入高效液相色譜儀，以峰面積Y對進樣濃度X求得回歸方程為Y=17 183X-3.156 2(r=0.999 8)。結果表明，獐牙菜苦苷在0.019～1.234 mg·mL-1內呈良好的線性關系，當藥苷在0.002～0.232 mg·mL-1內呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗取濃度為0.617 mg·mL-1的獐牙菜苦苷溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，每次進樣10 μL，獐牙菜苦苷峰面積的RSD值為1.13%；取濃度為0.007 mg·mL-1的當藥苷溶液，相同方法測定，當藥苷峰面積的RSD值為1.90%。結果表明該方法精密度良好。

2.6穩定性試驗取批號為74-KY-2012M的日本當藥粉末(過3號篩)約0.1 g，精密稱定，制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、3、5、7、9、12 h進樣(每次進樣10 μL)，計算獐牙菜苦苷及當藥苷含量，其RSD值分別為0.54%和1.36%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好；另于1、2、3、4、5 d進樣(每次進樣10 μL)，計算獐牙菜苦苷及當藥苷含量，其RSD值分別為1.52%和2.57%，表明供試品溶液在5天內穩定性良好。

2.7重復性試驗取批號為74-KY-2012M的日本當藥粉末(過3號篩)0.1 g，精密稱定，平行6份，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，計算得到獐牙菜苦苷及當藥苷平均含量分別為59.91 mg·g-1和1.84 mg·g-1，其RSD值分別為1.9%和2.5%，結果表明該方法重復性良好。

2.8加樣回收率考察取批號為74-KY-2012M的日本當藥粉末(過3號篩)0.05 g，置于三角燒瓶中，精密稱定，平行6份，分別精密加入獐牙菜苦苷對照品溶液(2.848 mg·mL-1)1 mL和當藥苷對照品溶液(0.144 mg·mL-1)1 mL，再用移液管精密移取8 mL的甲醇，按供試品溶液制備方法進行處理，測定并計算加樣回收率，獐牙菜苦苷和當藥苷的平均回收率分別為99.5%、99.9%，RSD分別為1.58%、2.10%，結果見表1。

2.9樣品測定

2.9.1不同產地日本當藥及當藥的含量測定取各批次日本當藥藥材粉末及當藥藥材粉末(過3號篩)約0.1 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別測定其中獐牙菜苦苷及當藥苷的含量，結果見表2。

表1　獐牙菜苦苷及當藥苷的加樣回收率( n=6)

表2　日本當藥及當藥中獐牙菜苦苷和當藥苷的含量比較( n=3)

由結果可知，浙江引種的日本當藥與日本產樣品相比，兩者HPLC色譜圖中成分種類基本一致，但個別成分相對含量不同，其中獐牙菜苦苷的含量以浙江產樣品較高，而當藥苷含量以日本產樣品較高。日本當藥與當藥成分差異顯著，尤其是獐牙菜苦苷的含量遠遠高于6批當藥商品中獐牙菜苦苷的含量，當藥苷的含量差異也比較明顯。

2.9.2日本當藥不同部位的含量測定從批號為74-KY-2012M及浙江-1 2批日本當藥藥材中挑揀出根、莖、葉和花4個部位，粉碎，精密稱取各個部位藥材粉末(過3號篩)約0.1 g，制備供試品溶液，分別測定其中獐牙菜苦苷及當藥苷的含量，結果見表3。

表3　日本當藥不同部位中獐牙菜苦苷和當藥苷的含量( n=3)

由上述表中結果可知，無論是日本產還是浙江引種的日本當藥中，獐牙菜苦苷及當藥苷在花中的含量都是最高的，而且遠遠高于其他部位，提示花期為日本當藥的最佳采收期。

3討論

獐牙菜苦苷及當藥苷是日本當藥和當藥的主要活性成分，本研究發現，無論是日本原產還是我國引種的日本當藥都富含獐牙菜苦苷，其含量不僅遠遠高于日本藥局方中日本當藥中的獐牙菜苦苷的含量標準(20 mg·g-1)[8]，也高于《中國藥典》2010年版中當藥中獐牙菜苦苷的含量標準(35 mg·g-1)[12]。而與《中國藥典》2010年版當藥的當藥苷含量標準(0.7 mg·g-1)[12]相對照，日本原產日本當藥含量明顯高于標準，引種的日本當藥含量略低于標準。因此，很有必要加強對國產日本當藥的開發利用，同時深入比較日本當藥與當藥的藥效差異。

我國獐牙菜屬植物有79種，市場上當藥品種混亂，質量參差不齊[9]。本研究從市場上收集到的6批當藥藥材質量差異明顯，其中當藥苷的含量基本符合現行《中國藥典》標準，但獐牙菜苦苷的含量都遠低于藥典標準，為不合格藥材，推測可能都是偽品或混淆品，其具體植物來源還有待鑒定，也說明現行當藥質量標準急需完善，以提高其真偽鑒別的專屬性。今后研究中，將收集足夠批次的正品當藥與日本當藥樣品，進行兩種當藥的比較與質量標準完善研究。

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