歸脾丸質量標準研究

歸脾丸質量標準研究

高輝，李曉燕，李冰，林曉

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

摘要：目的提高歸脾丸的質量標準。方法采用薄層色譜法對黨參、炙黃芪、遠志、當歸進行鑒別；用高效液相色譜-蒸發光散射法測定黃芪中黃芪甲苷的含量，色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(32∶68)；流速為1.0 mL·min-1，漂移管溫度105 ℃，氣體流量2.5 L·min-1。結果薄層色譜斑點清晰；黃芪甲苷在1.046 0～5.230 0 μg(r=0.999 8)的范圍內線性良好，平均回收率為101.24%(n=6)，RSD為1.92%。結論本法結果準確、可靠，可用于該制劑的質量控制。

關鍵詞：歸脾丸；薄層色譜法；高效液相色譜-蒸發光散射法

基金項目：山東省自然科學

作者簡介：高輝，女，主管藥師，研究方向：藥品檢驗和質量標準研究，E-mail：gaohui198311@126.com

通訊作者：李冰，男，主任藥師，研究方向：化學藥品檢驗，Tel：0531-81216513，E-mail：laaab123@gmail.com

中圖分類號：R927.1文獻標識碼：A

Study on the quality standard of Guipi Pills

GAOHui，LIXiao-yan，LIBing，LINXiao

(ShandongInstituteforFoodandDrugControl,Jinan250101,China)

Abstract：ObjectiveTo improve the quality standard of Guipi Pills for better controlling the quality of drugs.MethodsThe TLC was employed on Radix Astragali,honey-fried Radix Astragali，Radix Polygalae,Radix Angelicae Sinensis for identification;The content of astragaloside in Radix Astragali was determined by HPLC-ELSD.A Dikma Diamonsil C18 column(4.6 mm×250 mm，5 μm)was adopted with methanol-water(32∶68) as mobile phase at a flow rate of 1 mL·min-1.An eweaporative light-scattering detector (ELSD) Model 2000 was used with the drift tube temperature at 105 ℃ and the gas flow rate at 2.5 L·min-1.ResultsThe TLC chromatographic spots were clear；The linear range of astragaloside was 1.046 0～5.230 0 μg(r=0.999 8)，the average recovery was 101.24%，and RSD=1.92%(n=6).ConclusionThe results showed that this method was accurate,reliable and can be used for the preparation of quality control．

Key words:Guipi Pills;Thin-layer chromatography;HPLC-ELSD

歸脾丸由黨參、炒白術、炙黃芪、炙甘草、茯苓等15味中藥組成，具有益氣健脾，養血安神功效。用于治療心脾兩虛，氣短心悸，失眠多夢，頭昏頭暈，肢倦乏力，食欲缺乏，崩漏便血等[1]。近年來發現，歸脾丸對神經衰弱、竇性心動過緩及陣發性心動過速、冠心病、更年期綜合征、缺鐵性貧血、慢性苯中毒亦有較好的改善作用[2～4]。為有效控制本品質量，采用薄層色譜法(TLC)對處方主要藥味黨參、炙黃芪和遠志進行定性鑒別，并用高效液相色譜-蒸發光散射法(HPLC-ELSD)測定黃芪中有效成分黃芪甲苷的含量[5]，為全面控制產品質量提供依據。

1儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀；Alltech 2000 ELSD檢測器；Sartorius CP225D電子天平；KQ-300DE超聲波清洗儀。黃芪甲苷對照品(批號：110781-200512，中國藥品生物制品檢定所)；歸脾丸(山東沃華醫藥科技有限公司，批號：060301、060202、080201)；陰性樣品按處方制備；HPLC用甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水；TLC用試劑為分析純，水為純化水。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(32∶68)為流動相；流速為1.0 mL·min-1，柱溫35 ℃，漂移管溫度105 ℃，氣體流量2.5 L·min-1，進樣量為10 μL。

2.2溶液的制備對照品溶液：精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品重量差異項下的大蜜丸，剪碎，取約15 g，精密稱定，精密加入甲醇100 mL，稱定重量。密封，冷浸過夜，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液50 mL，水浴蒸干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨水充分洗滌3 次，每次40 mL，棄去氨水，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液：取缺炙黃芪陰性對照樣品，按比例同供試品的制備方法制得。

2.3薄層色譜鑒別

2.3.1黨參的薄層色譜鑒別[1,6]取黨參對照藥材1 g，同“2.2”項下的供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。同時取處方中除去黨參的其他藥味，按處方比例制成陰性對照樣品，取約4.5 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述兩種溶液及“2.2”項下的供試品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而且陰性對照無干擾，結果見圖1。

圖1　黨參的TLC鑒別圖譜 1.供試品060301；2.供試品060202；3.供試品080201； 4.黨參對照藥材；5.缺黨參陰性對照

2.3.2炙黃芪的薄層色譜鑒別[1,7]取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。同時取處方中除去炙黃芪的其他藥味，按處方比例制成陰性對照樣品，取約4.5 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述兩種溶液及“2.2”項下的供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃ 加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而且陰性對照無干擾，結果見圖2。

圖2　炙黃芪的TLC鑒別圖譜

2.3.3遠志的薄層色譜鑒別[1,8]取本品水蜜丸6 g，研碎；或小蜜丸或大蜜丸9 g，剪碎，加鹽酸無水乙醇溶液(10→100)20 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液加水30 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取遠志對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。同時取處方中除去遠志的其他藥味，按處方比例制成陰性對照樣品，取約4 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶8∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而且陰性對照無干擾，結果見圖3。

圖3　遠志的TLC鑒別圖譜

2.4含量測定[9,10]

2.4.1線性關系精密吸取0.209 2 mg·mL-1黃芪甲苷對照品溶液5、8、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，以黃芪甲苷的進樣量的對數值為橫坐標，峰面積的自然對數值為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程為：Y=1.315 7X+7.336 8，r=0.999 8，表明黃芪甲苷進樣量在1.046 0～5.230 0 μg范圍內與峰面積自然對數值呈良好的線性關系。

2.4.2精密度試驗精密吸取0.209 2 mg·mL-1黃芪甲苷對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續進樣5次。測定峰面積，以黃芪甲苷的峰面積的自然對數值計算，RSD為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩定性試驗精密吸取同一份供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，每隔2 h進樣1次，記錄黃芪甲苷的峰面積，共考察10 h，以黃芪甲苷的峰面積的自然對數值計算，RSD為1.17%，表明被測溶液在10 h內穩定。

2.4.4重復性試驗取同一批號的歸脾丸約15 g，共5份，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，按上述色譜條件測定，測得平均含量0.13 mg·g-1，RSD為1.14%(n=5)。

2.4.5加樣回收率試驗稱取已知含量的歸脾丸(批號：060202，黃芪甲苷含量為0.130 6 g·g-1)約7.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液(濃度0.209 2 mg·mL-1)各5 mL，按“2.2”項下操作方法制備，測定含量并計算回收率，結果平均回收率為101.24%，RSD為1.92%(n=6)。

2.4.6專屬性試驗分別精密吸取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結果，陰性對照溶液在與對照品色譜相同保留時間的位置上未顯色譜峰，故認為無干擾。結果見圖4。

圖4　歸脾丸(A)、黃芪陰性對照(B)及黃芪甲苷對照品(C)色譜圖

2.4.7樣品含量測定取3批樣品各2份，按照“2.2”項下的方法，分別制備樣品溶液，進行測定，以外標法計算，測定結果見表1。

表1　樣品測定結果

3討論

3.1薄層色譜法分別對處方中主要藥味黨參、炙黃芪和遠志制定了薄層色譜鑒別。各方法特征斑點鮮明，色譜分離清晰，并進行了耐用性考察，考察了不同薄層板(預制板和自制板)。結果證明對鑒別效果無明顯的影響。

3.2高效液相色譜法

3.2.1提取方法的考察試驗過程中考察了不同溶劑及提取方法(50%甲醇超聲提取、甲醇回流提取、50%甲醇硅藻土拌樣加熱回流、甲醇冷浸過夜后回流)、不同取樣量、提取時間和堿溶液。結果表明，取樣15 g，甲醇100 mL作為提取溶劑，冷浸過夜后回流、正丁醇提取，并用氨水洗滌提取效果最好，故選之。

3.2.2流動相的選擇參考有關資料，選擇以下2種流動相進行試驗：甲醇-水(75∶25)，乙腈-水(32∶68)。結果以乙腈-水(32∶68)的效果最為理想，故選之。

3.2.3耐用性的考察考察條件時使用了3種不同型號的色譜柱：Dikma Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，按上述確定的方法和條件進行測定，3種色譜柱所得的對稱因子、理論板數等均能符合《中國藥典》2010年版對高效液相色譜分析的有關要求，表明測定該方法測定黃芪甲苷，對色譜柱選擇性不強，適用范圍廣。

3.2.4本試驗結果表明，HPLC-ELSD法測定本制劑中黃芪甲苷的含量，具有簡便、快速、重現性好的特點。同時，采用含量測定供試品溶液作為兩個鑒別的供試品溶液，節約了成本和勞動力，為歸脾丸質量標準提高提供了實驗依據。

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