活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠體外受精胚胎發(fā)育的影響

崔陽陽，孫偉偉，趙瑞華，徐　彩，吳天思,2

(1．中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科，北京　100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京　100029)

活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠體外受精胚胎發(fā)育的影響

崔陽陽1，孫偉偉1，趙瑞華1，徐彩1，吳天思1,2

(1．中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科，北京100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

【摘要】目的評估活血消異方子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠體外受精胚胎發(fā)育的影響。方法通過體外受精的方法，觀察中藥組、模型組和假手術(shù)組的小鼠的促排卵數(shù)、受精率、二細胞分裂率、四細胞分裂率、桑葚胚形成率及最終桑葚胚形成率，觀察對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠體外受精胚胎發(fā)育的影響。探討內(nèi)異癥對小鼠體外受精后胚胎發(fā)育的影響及活血消異方對胚胎發(fā)育的作用。結(jié)果中藥組、模型組和假手術(shù)組，共三組。三組的平均促排卵數(shù)、體外受精率和二細胞分裂率差異有顯著性意義(P<0.05)，平均促排卵數(shù)、體外受精率和二細胞分裂率由高到低均依次為假手術(shù)組、中藥組和模型組；三組的四細胞分裂率差異有顯著性意義(P<0.05)，桑葚胚形成率差異無顯著性差異(P>0.05)，桑葚胚最終形成率差異有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥可降低模型小鼠促排卵數(shù)、體外受精率及卵裂率，影響胚胎發(fā)育質(zhì)量,活血消異方可改善胚胎發(fā)育質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；不孕；體外受精；胚胎發(fā)育

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EM，)簡稱內(nèi)異癥，是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織在宮腔以外的部位的一種雌激素依賴性疾病。是育齡婦女的常見病、多發(fā)病，以引發(fā)疼痛、不孕為特點。EM的發(fā)病率逐年上升且趨于年輕化，內(nèi)異癥是引起女性不孕的原因之一。內(nèi)異癥患者并發(fā)不孕高達40%～60%[1]而在不孕癥患者中也有40%～50%存在子宮內(nèi)膜異位癥，內(nèi)異癥患者不孕為非內(nèi)異癥人群的20倍[2]。可見，內(nèi)異癥與不孕有密切的聯(lián)系。2000年Buyalos等[3]首次提出“endometriosis-associated infertility”，即“內(nèi)異癥相關(guān)不孕癥”。

目前，手術(shù)治療是EM相關(guān)不孕的首要基本措施，隨著輔助生殖技術(shù)(ART)的發(fā)展及臨床應(yīng)用，已成為EM相關(guān)不孕患者最理想的助孕方式和治療手段。但在行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，其胚胎移植率達85%，而妊娠率僅為20%左右[4]。因此，如何提高EM相關(guān)不孕患者IVF妊娠率成為關(guān)注的熱點問題。由內(nèi)異癥患者行IVF-ET的高移植率和低妊娠率可見，胚胎著床則成為影響IVF-ET結(jié)局的關(guān)鍵性問題。本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，結(jié)合IVF技術(shù)，在前期工作的基礎(chǔ)上，通過建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，觀察子宮內(nèi)膜異位癥對模型小鼠體外受精后胚胎發(fā)育的影響，探討活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕患者胚胎發(fā)育的影響，為中醫(yī)藥進入輔助生殖領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)，為EM不孕癥提供更完善的治療方法。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級雌性昆明小鼠300只，7周齡，體重(25±3)g，用于模型小鼠的供體與受體；雄性昆明小鼠50只，10周齡，體重(33±2)g，用于精子供體及假孕鼠制作。購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所【SCXK(京)2009-0007】。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動物實驗室【SYXK(京)2009-0034】。日間照明交替(12L:12D),室溫22℃。實驗所需物品均經(jīng)過高壓滅菌。昆明小鼠雌鼠，昆明小鼠雄鼠。

1.2試劑和藥物

HTF和KSOM 培養(yǎng)液購自ARK-Resource(規(guī)格：2 mL/支，日本，熊本縣熊本市)。HTF用于體外受精，KSOM用于培養(yǎng)受精卵直到桑葚胚期，二種培養(yǎng)液使用前皆于5% CO2，恒溫37℃濕度飽和的培養(yǎng)箱中過夜預(yù)熱平衡；hCG(批號：110251282，規(guī)格：1000 IU×10支)和PMSG(批號：110254564，規(guī)格：1000 IU × 5支，寧波第二激素廠，中國)；礦物油購自(批號：101181433，規(guī)格：1 L/瓶Sigma，德國)；其他實驗用藥物(包括中藥)及試劑全部來自于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑室提供。

中藥活血消異方由莪術(shù)、丹參、赤芍、雞內(nèi)金、生薏仁組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑室提供。以上生藥加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并煎液、過濾，放置24 h，濃縮。藥物濃度為1.8 g生藥/mL，藥液4℃冰箱保存。

1.3實驗分組和用藥劑量

將實驗雌性昆明小鼠分為中藥組，模型組和假手術(shù)組進行子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的建立。其中，除子宮內(nèi)膜供體小鼠130只外，中藥組小鼠60只，死亡3只；模型組小鼠60只，死亡8只；空白組小鼠50只，死亡2只。

依據(jù)換算公式計算，小鼠等劑量的給藥量約為臨床成人每公斤體重用藥量的10倍。每只小鼠每次灌胃量為0.2 mL/10 g，連續(xù)3個周期(5 d為1周期)。模型組、空白組依據(jù)體重予等量0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)灌胃。

1.4子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的建立

造模前，連續(xù)1周每日定時作陰道涂片檢查[5](如圖1~2)，動情周期為3～5日，選擇動物周期正常的小鼠。通過內(nèi)膜碎片注射法[6,7]建立子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠，假手術(shù)組給予注射等量生理鹽水。模型建立2周后，開始進行中藥干預(yù)。

1.5超數(shù)排卵及卵子的采集

各組分別取供卵鼠腹腔注射PMSG，10 IU/只，48 h后腹腔注射hCG，10 IU/只。在注射hCG 14 h后進行取卵。脫頸處死供卵小鼠置于體視顯微鏡下(ZOOM2000，Leica，Germany)，打開小鼠腹腔,用鑷子將輸卵管、卵巢和脂肪墊拉出，再用小剪刀在輸卵管和卵巢之間剪開，然后再靠近輸卵管的子宮部剪開。將輸卵管和帶著的子宮部分轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中的礦物油中，在體視顯微鏡下，用16號針輕輕劃破輸卵管膨大的壺腹部，隨即云霧狀的卵子及卵丘團會釋放出來，將卵丘團引入HTF培養(yǎng)中。將取出的卵子置于5% CO2、恒溫37℃、濕度飽和的培養(yǎng)箱中等用。

1.6精子的采集

脫頸處死雄鼠，在體視顯微鏡下，開腹進入腹腔找出睪丸，剪下睪丸及附睪，迅速分離出附睪尾和輸精管，盡可能去除脂肪和血管，置于礦物油中，使用26號針于附睪尾遠端小管處刺破，慢慢擠出精子，挑出精子置于HTF培養(yǎng)滴中，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中靜置1 h使精子獲能。受精時，精子的濃度約為(1～2)× 106個/mL。

1.7體外受精

精子獲能后，將精子加入卵子培養(yǎng)皿中，5 μL/滴，重新置于培養(yǎng)箱中靜置6 h。6 h后使用HTF 沖洗受精卵2～3次，沖洗后將受精卵置于新的KSOM培養(yǎng)液中，在倒置顯微鏡下對受精卵進行計數(shù)后，重新置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。受精24 h后，可見到較早卵裂的2細胞。這些2細胞用于培養(yǎng)至桑葚胚，觀察卵裂及胚胎發(fā)育情況和進行2細胞移植的2細胞供體。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件包分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，①在總頻數(shù)n≥40且所有理論頻數(shù)≥5時，用Pearson χ2統(tǒng)計量；②在總頻數(shù)n>40但≥1時,用校正χ2統(tǒng)計量；③在總頻數(shù)n<40或理論頻數(shù)<1時，用Fisher確切概率法檢驗，組間比較采用兩兩四格表的χ2檢驗。按α=0.05水準(zhǔn),P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義；P>0.05為差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2實驗結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型建立

建模2周后，小鼠腹部皮下可觸及米粒大小的結(jié)節(jié)。子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的建立結(jié)果顯示(圖1～2)：在皮下和腹腔均見有病灶生成，異位病灶生長良好，小鼠皮下病灶，肉眼觀多為白色、紅色或淡黃色的米粒大小的結(jié)節(jié)或囊狀病灶，活動度小；小鼠腹腔內(nèi)病灶，肉眼觀多為隆起囊狀，囊內(nèi)充滿淡黃色清亮透明或混濁粘稠積液，表面血管清晰可見，病灶2 mm3～5 mm3大小不等。小鼠皮下及腹腔有不同程度的粘連。病灶的HE染色(圖3,見彩插2)可見：切片中可見有血管生成，并有大量腺體存在。可見，子宮內(nèi)膜異位癥小鼠“腹腔+皮下”注射法建立模型的成功率達90%以上。

2.2活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠促排卵數(shù)的影響三組小鼠的促排卵情況(表1)。通過單因素方差分析，三組平均促排卵數(shù)差異有顯著性意義(P<0.05)。通過LSD法進行兩兩比較，模型組平均促排卵數(shù)明顯低于中藥組與假手術(shù)組(P<0.05)；而假手術(shù)組和中藥組的平均促排卵數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。促排卵數(shù)由高到低依次為：假手術(shù)組、中藥組、模型組。

圖1　子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型皮下內(nèi)異位癥灶Fig.1　Ectopic subcutaneous lesions in the mouse models of endometriosis

圖2　子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型腹腔內(nèi)異位癥灶Fig.2　Ectopic lesions in the abdominal cavity of mouse models of endometriosis

組別Groups只數(shù)n取卵總數(shù)No.ofsuperovulation均值±標(biāo)準(zhǔn)差x-±sFP中藥組TCMgroup57299552.04±7.19*模型組EMmodelgroup52174932.93±8.9877.790.000假手術(shù)組Sham-operatedgroup48323660.02±1.51*

Note. Data were expressed in mean±SD. *Compared with the EM model group (P<0.05).

表2　三組體外受精率的比較(%)

*與模型組比較，P<0.05 Δ與假手組比較，P<0.05

Note. *Compared with the EM model group (P<0.05); Δ Compared with the sham-operated group (P<0.05).

表3　三組卵細胞的二細胞分裂率比較(%)

*與模型組比較，P<0.05Δ與假手組比較，P<0.05

Note.*Compared with the EM model group (P<0.05);ΔCompared with the sham-operated group (P<0.05).

2.3活血消異方對內(nèi)異癥模型小鼠體外受精率的影響

三組小鼠的體外受精情況(表2)。通過χ2檢驗，三組受精率差異有顯著性意義(P<0.05)。通過四格表的χ2檢驗兩兩比較：中藥組與模型組、模型組與假手術(shù)組、中藥組與假手術(shù)組的體外受率差異均有顯著性意義(P<0.05)。體外受精率由高到低依次為：假手術(shù)組、中藥組、模型組。

2.4活血消異方對內(nèi)異癥模型小鼠胚胎發(fā)育的影響

三組小鼠體外受精后二細胞分裂情況(表3，圖4見彩插2)。通過χ2檢驗，三組卵細胞的二細胞分裂率差異有顯著性意義(P<0.05)。通過四格表的χ2檢驗兩兩比較：模型組卵細胞的二細胞分裂率明顯低于中藥組與假手術(shù)組(P<0.05)；中藥組二細胞分裂率明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。

三組小鼠體外受精后四細胞分裂率(圖5見彩插2，表4)。 通過χ2檢驗，三組卵細胞的四細胞分裂率差異有顯著性意義(P<0.05)。通過四格表的χ2檢驗兩兩比較：中藥組與模型組卵細胞的四細胞分裂率明顯低于假手術(shù)組(P<0.05);模型組與中藥組的四細胞分裂率無顯著性差異(P>0.05)。

三組小鼠體外受精后桑葚胚形成率(圖6見彩插2、表5)。通過χ2檢驗，三組桑葚胚形成率差異無顯著性(P>0.05)。

通過觀察三組小鼠體外受精后，胚胎發(fā)育的情況，其總?cè)÷褦?shù)、受精數(shù)、二細胞分裂數(shù)、四細胞分裂數(shù)、桑葚胚形成數(shù)情況見圖7。

表4　三組卵細胞的四細胞分裂率比較(%)

*與模型組比較，P<0.05Δ與假手組比較，P<0.05

Note.*Compared with the EM model group (P<0.05);ΔCompared with the sham-operated group (P<0.05)

表5　三組桑葚胚形成率比較(%)

表6　三組桑葚胚最終形成率比較(%)

圖7　三組體外受精后胚胎發(fā)育情況 Fig.7　The embryonic development after IVF

三組小鼠體外受精后，由受精卵最終形成桑葚胚的桑葚胚形成率見表6。通過χ2檢驗，三組桑葚胚最終形成率差異有顯著性(P<0.05)。

3討論

古代文獻中未對子宮內(nèi)膜異位癥的病名進行記載，但根據(jù)本病的病因、病機及臨床表現(xiàn)可歸于“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”“月經(jīng)不調(diào)”等疾病的范疇。

中醫(yī)認為血瘀為子宮內(nèi)膜異位癥的公認病機。瘀血是本病的主要致病因素和病理產(chǎn)物。瘀血阻滯，不通則痛；血瘀日久，可成癥積。我院李光榮教授以“離經(jīng)之血”立論，組成系列方藥，其中核心藥物(丹參、赤芍、莪術(shù)等)組成活血消異方，臨床療效顯著。方中丹參，有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛之功效。赤芍，出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，有活血祛瘀、散瘀止痛之功。莪術(shù)，始載于《藥性論》，能入氣分血分而行氣血之滯，有破血祛瘀、行氣消積止痛之功。活血消異方中，以丹參、赤芍、莪術(shù)相伍，共奏活血化瘀、散結(jié)止痛之效。

前期臨床研究發(fā)現(xiàn)活血法對EM不孕患者有助孕療效，實驗研究顯示活血消異方能縮小異位內(nèi)膜體積，改善EM的組織病理形態(tài)；有效降低血清及異位內(nèi)膜組織中ICAM-1、MMP-9、VEGF的蛋白表達。臨床研究表明[8,9]，補腎活血治療可以提高EM患者子宮內(nèi)膜容受性，誘發(fā)成熟卵泡排卵，促進黃體發(fā)育，提高黃體功能。談勇[10]認為EM患者IVF-ET周期的各階段采用補腎活血法治療，可獲得良好的妊娠率。同時，結(jié)合目前臨床西醫(yī)使用阿司匹林改善患者子宮內(nèi)膜容受性的治法，我們認為活血化瘀治療EM的助孕機理，可能從改善胚泡質(zhì)量而提高妊娠率。

本研究通過建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，結(jié)合IVF技術(shù)，通過觀察小鼠體外受精以及受精后胚胎卵裂和發(fā)育情況，研究發(fā)現(xiàn)EM可降低模型小鼠的平均促排卵數(shù)、體外受精率、受精后二細胞及四細胞卵裂率和桑葚胚最終形成率，而對體外受精后四細胞發(fā)育至桑葚胚期的桑葚胚形成率無影響。活血消異方可提高模型小鼠的平均促排卵數(shù)、體外受精率、受精后二細胞及四細胞卵裂率和桑葚胚最終形成率，而對體外受精后四細胞發(fā)育至桑葚胚期的桑葚胚形成率無影響。因此，EM影響胚胎早期發(fā)育，降低胚胎發(fā)育質(zhì)量，而活血消異方可能通過改善胚胎發(fā)育環(huán)境，從而提高胚胎質(zhì)量，從而提高EM相關(guān)不孕的妊娠率。

子宮內(nèi)膜異位癥會影響卵泡發(fā)育過程的不同階段：引起卵泡生長缺陷；卵細胞質(zhì)量差；卵泡發(fā)生黃體化不破裂；輸卵管周邊受到侵蝕，功能受損；精子在宮腔內(nèi)活動性減弱；卵細胞受精能力下降；胚胎卵裂減慢；胚胎著床能力下降。

在排卵過程中，卵泡液隨著卵細胞一起從卵泡中被釋放出來，因而有可能對受精過程和胚胎的發(fā)育產(chǎn)生一定影響。李新玲等[11]研究結(jié)果表明，EM患者的卵泡液與鼠胚共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各期胚胎的發(fā)育受到抑制，提示EM患者卵泡液可能抑制早期胚胎的發(fā)育并存在毒性作用。EM患者在位子宮內(nèi)膜與鼠胚共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各期胚胎發(fā)育均受到明顯抑制，推測內(nèi)異癥可能影響胚胎發(fā)育，降低胚胎質(zhì)量，這可能是導(dǎo)致內(nèi)異癥相關(guān)不孕的原因之一。

胚泡植入是建立妊娠的第一步，目前己知性激素、細胞因子、免疫因子、糖類、肽類以及酶類等物質(zhì)對植入的調(diào)控至關(guān)重要，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其天然抑制劑(TIMPs)這一組鋅依賴性的蛋白水解酶與胚泡植入密切相關(guān)。故MMPs在胚泡植入時溶解ECM以利著床，在月經(jīng)期分解ECM以利內(nèi)膜剝脫。在此過程中，MMPs對宿主ECM的溶解作用受TIMPs的調(diào)控。Tabibzadeh等[12]發(fā)現(xiàn)在植入的小鼠胚泡中主要的蛋白酶是MMP-9，而在這一過程中小鼠宮內(nèi)膜產(chǎn)生的TIMP是TIMP-3，使用定量RT-PCR可以檢測植入過程中TIMP-3 mRNA表達。Wang等[13]通過RT-PCR檢測了植入前胚胎發(fā)育的不同階段TIMPs mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)TIMP-1，-3mRNA在胚胎發(fā)育的全部階段中都檢測到，而在接近植入前的階段，表達TIMP-1，-3mRNA的胚胎數(shù)量明顯增加。因此，我們認為，EM可能導(dǎo)致胚泡種植過程中對子宮內(nèi)膜ECM的過度溶解，從而導(dǎo)致著床失敗。活血消異方能通過調(diào)整胚泡MMP-9/TIMP-3的平衡，改善胚泡著床情況。但本研究尚未對胚胎及子宮內(nèi)膜進行分子和基因相關(guān)的檢測，尚待進一步深入研究。

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，造福了一大批EM相關(guān)不孕的患者。但輔助生殖技術(shù)并不能解決所有問題。如何安全、有效地提高EM患者妊娠率，是中西醫(yī)共同面臨的難題。本研究通過行體外受精觀察胚胎發(fā)育情況來探討活血消異方對EM相關(guān)不孕患者的胚胎質(zhì)量，為中醫(yī)藥提高EM妊娠率提供科學(xué)依據(jù)，并為進一步探討中醫(yī)藥在EM輔助生殖領(lǐng)域中的作用及調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

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〔修回日期〕2015-06-13

研究報告

Effects of a Chinese traditional medicine, Huoxue Xiaoyi Fang, on embryo

development after in vitro fertilization in mouse models of endometriosis

CUI Yang-yang1, SUN Wei-wei1, ZHAO Rui-hua1， XU-Cai1, WU Tian-si1,2

(1. Department of Gynecology, Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China；

2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029)

【Abstract】ObjectivesTo evaluate the effect of a Chinese traditional medicine, Huoxue Xiaoyi Fang, on the embryo development after in vitro fertilization (IVF) in mouse models of endometriosis. Methods To observe the quantity of oocytes including the average number of superovulation, fertility rate, 2-cell and 4-cell embryo cleavage rates at different stages in vitro fertilization, and morulation rate among the traditional Chinese medicine group (TCM group), endometriosis model group (EM model group) and sham-operated group. To explore the influence of endometriosis and the effect of Huoxue Xiaoyi Fang on the quantity of oocytes and embryonic development after IVF in the mouse models of endometriosis. Results All the average number of superovulation, fertility rate, 2-cell and 4-cell embryo cleavage rates in the three groups showed significant differences (P<0.05), and the average number of superovulation was in an order of sham operated group>TCM group>model group. There were no significant differences in the morulation rates in the three groups (P>0.05). There were significant differences among the IVF rates of the three groups (P<0.05), and to be in an order of sham operated group>TCM group>model group. There were significant differences in the final morulation rate among the three groups (P<0.05). ConclusionsEndometriosis may influence the quality of embryonic development of EM model mice, including reduced average number of superovulation, fertility rate, and embryo cleavage rate. The Chinese traditional medicine Huoxue Xiaoyi Fang can improve the the quantity of embryonic development after IVF.

【Key words】Endometriosis; Infertility; in vitro fertilization; Embryos quality; Mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.007

【中圖分類號】R-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0031-06

[通訊作者]趙瑞華，女，博士生導(dǎo)師, 研究方向: 子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥、月經(jīng)失調(diào)方向。 E-mail: rhzh801@126.com。

[作者簡介]崔陽陽(1987-)，女，碩士，專業(yè):中醫(yī)婦科學(xué)，E-mail: cuiyang870216@163.com。

[基金項目]國家自然科學(xué)基金(No:81173297)。