RNAi沉默KDM2A基因對人肝癌MHCC-97H細胞增殖、侵襲及遷移的影響

王軍，常江，蔣敢(武警陜西省總隊醫院，西安710054)

RNAi沉默KDM2A基因對人肝癌MHCC-97H細胞增殖、侵襲及遷移的影響

王軍，常江，蔣敢
(武警陜西省總隊醫院，西安710054)

摘要:目的探討沉默KDM2A基因對人肝癌MHCC-97H細胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法利用RT-PCR法檢測KDM2A在肝癌細胞系和正常肝細胞系中的表達;分別將KDM2A-siRNA 1#、KDM2A-siRNA 2#和NC轉入KDM2A表達量高的MHCC-97H細胞中，利用RT-PCR法檢測KDM2A的沉默率;采用MTT法檢測細胞的增殖能力;采用Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力。結果KDM2A在肝癌MHCC-97H細胞系中高表達; KDM2A-siRNA 1#和KDM2A-siRNA 2#的沉默率分別為35.2%和46.8%;沉默KDM2A后MHCC-97H細胞的增殖能力、侵襲遷移能力明顯降低(P均＜0.05)。結論RNAi沉默KDM2A基因表達能抑制MHCC-97H細胞的增殖、侵襲和遷移。

關鍵詞:肝腫瘤; KDM2A基因;細胞增殖;侵襲遷移

肝癌是目前最為常見惡性腫瘤之一，占全世界腫瘤發生率的第六位，其惡性程度高、預后差［1］。研究［2］發現，在肝癌發生、發展過程中經歷一系列的遺傳學和表觀遺傳學改變。KDM2A是一種組蛋白去甲基化酶，具有催化組蛋白上的亮氨酸殘基發生去甲基化修飾的功能，從而調控基因表達。KDM2A在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的增殖、侵襲及轉移能力相關［3，4］。我們利用RNAi技術沉默KDM2A基因在肝癌細胞系MHCC-97H中的表達，探討KDM2A被沉默后細胞的增殖、遷移和侵襲能力改變情況，為進一步探索肝癌發生發展的分子機制提供依據。

1　材料與方法

1.1材料人肝癌細胞系MHCC-97H(上海復旦大學肝癌研究所)、SMCC-7721、Huh7、HepG2和人正常肝細胞系HL-7702(上海中科院細胞庫)。DMEM培養液，胎牛血清(Gibco公司)?？俁NA的提取與逆轉錄及cDNA擴增均采用Takara(中國)試劑盒。KDM2A和內參β-actin引物均由上海生工合成。KDM2A上游引物: 5'-CCAAAGGTGCGGGTTCCTAC-3'，下游引物: 5'-GGCTCCTGACACAATCGGG-3'。Lipofectamine 2000(Invitroge公司)，KDM2A siRNA、siRNA-NC(吉瑪，上海)。

1.2細胞培養及轉染肝癌細胞系及正常肝細胞系均用含10 %胎牛血清的DMEM培養液培養，培養條件為37℃、5 % CO2、飽和濕度。取對數生長期細胞進行轉染，具體操作按Lipofectamine 2000說明書進行。

1.3細胞總RNA的提取及cDNA的合成轉染48 h后采用Takara試劑盒從細胞中提取細胞總RNA，具體操作參見試劑盒說明書。提取出的RNA置于－80℃低溫冰箱備用。使用Takara公司逆轉錄試劑盒，按說明書進行cDNA合成。

1.4 KDM2A基因表達檢測采用RT-PCR法。使用實時定量PCR試劑盒，按說明書操作。PCR反應體系: 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，目的基因正義鏈、反義鏈引物各1 μL，cDNA模板2 μL，無RNAase水8.5 μL，總反應體系25 μL。PCR反應在IQ5實時定量PCR儀上進行。PCR反應條件: 95℃預變性3min，95℃變性5 s，59℃退火延伸40 s，擴增40個循環，建立溶解曲線。每個反應孔設3個復孔，采用儀器自帶分析軟件，運用2－ΔΔCT法分析KDM2A基因相對表達量，以β-actin作為內參照。分別將KDM2A-siRNA 1#(KDM2A-siRNA 1#組)、KDM2A-siRNA 2#(KDM2A-siRNA 2#組)和NC(NC 組)轉入KDM2A表達量最高的肝癌細胞系中，利用RT-PCR檢測KDM2A在上述三組細胞中的表達量。選取沉默率高的細胞進行后續實驗。

1.5細胞增殖力檢測將轉染KDM2A-siRNA和siRNA-NC后的細胞以2×103個/孔接種于96孔板中培養，每組設5個復孔，鋪5塊96孔板。分別于

接種后第1、2、3、4、5天各取1塊96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后，避光吸棄上清液，然后每孔加入150 μL的DMSO，輕微振蕩10min后于酶聯免疫檢測儀490 nm處測量并記錄每孔的光密度(OD)值。取5復孔平均OD值，根據數據繪制細胞增殖曲線。

1.6細胞遷移和侵襲能力檢測將轉染KDM2A-siRNA和siRNA-NC后的細胞以2×104個/室接種于8 μm厚的Transwell小室進行細胞遷移和侵襲實驗。按1∶6比例稀釋Matrigel基質膠，吸取100 μLmatrigel稀釋液加入上層小室，37℃靜置30min后水化30min。遷移實驗中無需鋪基質膠。上室用無血清培養基培養細胞，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于培養箱中培養。24 h后，吸棄小室內培養液，95%乙醇固定細胞10min，擦除上室中細胞，0.5 %的結晶紫染色30min。200倍光鏡下分別取10個視野進行計數和統計學分析。1.7統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量數據以珋x±s表示，采用獨立樣本t檢驗或卡方檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 KDM2A在肝癌細胞系中的表達KDM2A在肝癌細胞系HepG2、Huh7、SMCC-7721和MHCC-97H的表達(1.96±0.096、2.48±0.108、3.24± 0.450、5.62±0.576)均明顯高于正常肝細胞系HL-7702(1.0±0.087)，且在MHCC-97H中表達最高(P ＜0.05)。

2.2 KDM2A-siRNA的沉默率KDM2A-siRNA 1#、KDM2A-siRNA 2 #的沉默率分別為35.2 %和46.8%，兩者比較，P＜0.05。

2.3 KDM2A-siRNA對肝癌細胞增殖的影響收集到KDM2A-siRNA 2 #細胞5個時間點的OD值(0.350±0.011、0.593±0.019、0.672±0.020、0.852±0.021、1.159±0.014)和NC組細胞5個時間點的OD值(0.359±0.011、0.664±0.039、0.849 ±0.014、1.094±0.020、1.560±0.025)，繪制出兩組細胞的生長曲線。與NC組相比，KDM2A-siRNA 2#組細胞增殖速度明顯減慢(P均＜0.05)，見圖1。2.4 KDM2A-siRNA對肝癌細胞遷移和侵襲的影響

NC組侵襲和遷移的細胞數量分別為(58±6)個/視野和(67±8)個/視野，KDM2A-siRNA 2#組分別為(29±5)個/視野和(35±4)個/視野，兩組比較P均＜0.05。

3　討論

圖1　NC組、KDM圖2A-siRNA 圖2#組MHCC-圖97H細胞生長曲線

肝癌是目前臨床最常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、進展速度快、治療復雜、生存時間短等特點。肝癌的發生發展經歷癌基因ras、myc等的激活［5］和抑癌基因p53、Rb［6］等的失活。近年來研究［7］表明表觀遺傳學的改變亦參與到肝癌發生發展過程中，如DNA甲基化修飾、組蛋白修飾等。組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學修飾方式，由組蛋白賴氨酸和精氨酸甲基轉移酶所介導，可調節基因的轉錄［8］。Hamamoto等［9］發現H3K4甲基化SMYD3在肝癌中高表達，并促進癌細胞增殖; Fan等［10］實驗表明，SUV39H1的高表達增加肝癌細胞的遷移能力，敲除SUV39H1可明顯抑制肝癌細胞增殖; He等［11］實驗發現，H3K4me3在早期肝癌的表達水平越高，預后越差，可作為判定預后的標志?？梢娊M蛋白的甲基化在肝癌發生發展過程中有重要作用。

KDM2A亦可稱為FBL7、FBXL11、FBL11或JHDM1A，具有E3連接酶的F-box結構域和組蛋白去甲基化結構域，具有催化單甲基化或二甲基化的組蛋白H3K36發生去甲基化的作用，進而抑制基因的轉錄［12］。在細胞有絲分裂過程中，KDM2A參與維持絲粒完整性和基因組穩定性［13］。最近研究發現，KDM2A在肺癌和胃癌高表達，具有促進細胞增殖和侵襲遷移的能力，起到促癌基因的作用，而沉默KDM2A表達后，能抑制肺癌和胃癌的發生發展［4，14］。

本研究發現KDM2A在肝癌細胞系中均高表達，而在MHCC-97H中表達最高。隨后利用RNAi技術成功沉默KDM2A在肝癌細胞中的表達，MTT 和Transwell實驗表明，沉默KDM2A表達后能抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。后續實驗我們將進一步驗證KDM2A在肝癌組織中的表達，并探索其調控肝癌發生發展的可能分子機制。

參考文獻:

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收稿日期:( 2015-04-18)

文章編號:1002-266X(2015)33-0030-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.010