氧化應激誘導自噬對骨髓間充質干細胞增殖與凋亡的影響*

劉關羽，　何衛陽，　朱　鑫，　楊　帆，　黃小龍，　印胡濱，　茍　欣

(1重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，2分子腫瘤及表觀遺傳學重慶市重點實驗室，重慶 400016)

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氧化應激誘導自噬對骨髓間充質干細胞增殖與凋亡的影響*

劉關羽1, 2，何衛陽1△，朱鑫1，楊帆1，黃小龍1, 2，印胡濱1, 2，茍欣1

(1重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，2分子腫瘤及表觀遺傳學重慶市重點實驗室，重慶 400016)

[摘要]目的： 觀察氧化應激是否可誘導骨髓間充質干細胞(MSCs)自噬，探索在氧化應激微環境中自噬對MSCs增殖和凋亡的影響及可能機制，以期提高移植MSCs治療糖尿病勃起功能障礙(DMED)的效果。方法: 以過氧化氫(H2O2)模擬氧化應激微環境。臺盼蘭染色細胞計數法及MTT分析檢測不同濃度(0 、50、100、200、400 μmol/L)H2O2對MSCs增殖的影響。聯合MTT、流式細胞術、Western blot及透射電鏡等方法研究H2O2對MSCs凋亡及自噬的影響。結果: H2O2呈濃度依耐性抑制MSCs增殖，IC50=(384.5751±16.8895)μmol/L；Western blot分析及透射電鏡提示H2O2在誘導MSCs凋亡的同時，誘導MSCs產生自噬；MTT分析及流式細胞術提示H2O2組細胞增殖受抑、凋亡率上升，阻斷自噬后細胞增殖進一步減弱，凋亡率進一步上升；Western blot結果提示H2O2誘導cleaved caspase-3增多及多聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)裂解增強；阻斷凋亡后，cleaved caspase-3降低及PARP1裂解減弱；阻斷自噬后，cleaved caspase-3進一步增多及PARP1裂解進一步增強。結論: 氧化應激對MSCs存活具有雙重作用，在誘導MSCs凋亡的同時還誘導保護性自噬，阻斷MSCs自噬可以增加MSCs的凋亡，因此進一步增強細胞保護性自噬將有望提高移植MSCs在糖尿病高氧化應激微環境中的存活率，從而改善移植MSCs對糖尿病勃起功能障礙的療效。

[關鍵詞]自噬； 間充質干細胞； 細胞增殖； 細胞凋亡； 氧化應激

據報道，截至2030年，全球糖尿病患者將達3.36億，約半數糖尿病患者同時伴有勃起功能障礙(erectiledysfunction，ED)[1]。糖尿病病人患ED比非糖尿病人早10～15年，其ED嚴重程度也更高，嚴重影響著患者的家庭生活以及社會和諧[2]。在糖尿病高糖狀態下，氧化應激微環境損害陰莖海綿體神經和內皮細胞，神經元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)和內皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)活性降低，一氧化氮釋放減少，這是糖尿病勃起功能障礙(diabetesmellituserectiledysfunction，DMED)的主要發病機制之一[3]。目前治療ED的一線藥物主要是磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesteraseinhibitors5，PDEI5)，但其對DMED卻療效甚微[4]。

骨髓間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)因在具體微環境中可定向分化為陰莖海綿體血管內皮細胞和平滑肌細胞而被用于治療DMED的研究[5]，但前期研究表明，MSCs移植后對勃起功能改善作用持續7～28d后就逐漸消失[6-7]，推測可能與移植的MSCs無法適應糖尿病患者陰莖海綿體內高氧化應激微環境而出現異常細胞凋亡有關[8-9]。因此，如何提高移植MSCs存活率成為亟待解決的問題。

細胞自噬是一個降解細胞內受損蛋白及細胞器并為細胞增殖提供再利用原料的復雜過程，對MSCs自我更新、分化及存活起非常重要的調節作用[10]。一定程度的自噬對細胞存活起保護作用，但過度自噬又會導致細胞死亡，自噬和凋亡的關系復雜，通過多個細胞信號系統相互影響[11-12]。本實驗擬通過調節MSCs自噬水平，觀察在氧化應激作用下自噬對MSCs增殖和凋亡的影響，為改善MSCs移植治療DMED提供理論依據。

材料和方法

1主要試劑和儀器

小鼠骨髓間充質干細胞株C3H10購于ATCC；DMEM/F12培養基購自HyClone；胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)購自Gibco；青霉素、鏈霉素購自北京碧云天生物技術研究所；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，MTT]為Amresco分裝產品；氟聚偏乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜、增強型化學發光液(enhancedchemiluminescence，ECL)購自Millipore；預染蛋白Marker購自Thermo； 自噬抑制劑氯喹(chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)及微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3)I抗購自Sigma；caspase抑制劑z-VAD購自Selleck；cleaved-caspase-3I抗購自CST；P62及多聚ADP-核糖聚合酶1(poly-ADP-ribosepolymerase1，PARP1)I抗購自BD；β-actinI抗購自鐘鼎公司；II抗購自Abgen。倒置相差顯微鏡(Olympus)；凝膠成像儀(FusionFX)；流式細胞儀(BectonDickinson)；透射顯微鏡(HITACHI)。

2主要方法

2.1細胞培養MSCs培養在含10%FBS和1%青、鏈霉素的DMEM/F12培養基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中常規傳代培養。取對數生長期細胞用于實驗。

2.2細胞計數法檢測細胞增殖變化收集對數生長期細胞按1×104/cm2接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%融合時加入不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)H2O2。分別向各孔加入對應濃度H2O2，處理細胞24 h后胰酶消化下各孔細胞并用臺盼蘭染色計數。

2.3MTT實驗檢測細胞活力的變化根據H2O2濃度不同將細胞分成 0、50、100、200、400 μmol/L 共5組；根據加入抑制劑不同，將細胞分為 對照組(常規培養)、H2O2組、H2O2+ z-VAD組、 H2O2+3-MA組、H2O2+CQ組及H2O2+CQ+z-VAD組，共6組，其中3-MA為5 mmol/L ，CQ為10 μmol/L，z-VAD為20 μmol/L，各抑制劑均預處理細胞30 min。收集對數生長期的MSCs，按每孔1×104接種于96孔板培養至細胞融合度達70%～80%，按上述分組加入H2O2處理細胞24h，換液，加入5g/LMTT試劑作用4h，棄上清，洗滌，再加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解紫藍色結晶物甲瓚，于570nm處測吸光值(A)。每組設3復孔，重復實驗3次，計算各組細胞活力抑制率。抑制率=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

2.4Westernblot實驗MSCs培養至70%～80%融合，H2O2處理細胞不同時間(針對凋亡相關蛋白cleavedcaspase-3及PARP1處理0、2、4、8h；針對自噬相關蛋白LC3、P62處理0、1、2、4、8h)后提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度后蛋白變性，按40μg/孔上樣進行SDS-PAGE分離蛋白，再將蛋白轉印至PVDF膜，脫脂奶粉常溫封閉1～2h，I抗4 °C過夜，洗膜，II抗常溫孵育1～2h，再洗膜，ECL發光液顯影。“自噬潮”實驗分為對照組(常規培養)、CQ處理細胞2.5h組、H2O2處理細胞2h組、H2O2+CQ合用藥組，其中合用藥組先用CQ預處理細胞0.5h，再加入H2O2繼續處理2h，提取細胞總蛋白檢測LC3表達變化。根據加入抑制劑不同分組如下：對照組(常規培養)、H2O2處理細胞8h組、H2O2+z-VAD合用藥組、H2O2+CQ合用藥組、H2O2+CQ+z-VAD合用藥組，各合用藥組均先用抑制劑(z-VAD、CQ)預處理細胞0.5h，再加入H2O2繼續處理8h，提取細胞總蛋白檢測cleavedcaspase-3表達及PARP1裂解變化。以上各組中H2O2濃度均為300μmol/L，CQ均為10μmol/L，z-VAD均為20μmol/L。

2.5透射掃描電鏡檢測細胞自噬體實驗分為正常組(常規培養)和H2O2(300μmol/L)處理細胞 4h組。MSCs培養至70%～80%融合，按上述分組處理細胞后收集細胞并用PBS洗滌1～2次，離心后棄上清，加入2.5%戊二醛4 ℃固定，送樣檢驗細胞自噬體。

2.6流式細胞術AnnexinV/PI雙標法檢測細胞凋亡以下各組中H2O2濃度為300μmol/L，CQ均為10μmol/L，z-VAD均為20μmol/L。分為對照組(未做任何處理)、H2O2處理組、H2O2+z-VAD合用藥組、H2O2+CQ合用藥組、H2O2+CQ+z-VAD合用藥組，各合用藥組均先用抑制劑(z-VAD、CQ)預處理細胞 0.5h，再加入H2O2繼續處理8h。將細胞培養至70%～80%融合，按上述分組處理細胞后，消化收集所有培養液及細胞，按AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒說明操作，1h內上機檢測細胞凋亡。

4統計學處理

用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間兩兩比較使用Bonferroni-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1MSCs增殖抑制率隨H2O2濃度增加逐漸上升

用不同濃度(0、50、100、200、400μmol/L)H2O2處理細胞24h，臺盼蘭計數及MTT法檢測細胞增殖抑制率，發現隨H2O2濃度的上升，MSCs增殖抑制率逐漸上升，IC50=(384.5751±16.8895)μmol/L，選擇300μmol/L作為后續實驗的基礎濃度，見圖1。

Figure1.TheeffectsofH2O2atdifferentconcentrationsoncellviabilityandproliferationofMSCsafter24h.Mean±SD. n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1不同濃度H2O2處理MSCs24h對其存活及增殖的影響

2H2O2在誘導MSCs凋亡的同時，誘導MSCs自噬

用H2O2(300μmol/L)處理細胞不同時間(0、2、4、8h)，Westernblot檢測發現隨時間推移，cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1裂解逐漸增強。用H2O2處理細胞不同時間(0、1、2、4、8h)發現，隨時間推移，LC3-Ⅱ 表達逐漸上調，P62表達逐漸下調，提示H2O2誘導MSCs發生自噬。為進一步明確LC3-Ⅱ 表達上調是自噬引起而非自噬底物降解受阻造成的結果，本實驗進一步檢測“自噬潮”。H2O2組及CQ組LC3-Ⅱ 表達較正常組有一定程度上調；而H2O2+CQ組LC3-Ⅱ表達較H2O2組又進一步上調，表明LC3-Ⅱ的上調是H2O2誘導的自噬而非自噬底物降解受阻造成的結果。透射電鏡結果顯示，與正常組對比，H2O2處理細胞4h后引起MSCs自噬體明顯增加。以上結果提示H2O2在誘導MSCs發生凋亡的同時誘導MSCs發生自噬，見圖2。

Figure2.BothapoptosisandautophagywereinducedbyH2O2.Theblackarrowindicatedtheautophagybodycontainingdigestiveendproducts.Mean±SD. n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05 vsCQgroup;△P<0.05vsH2O2group.

圖2H2O2在誘導MSCs發生凋亡的同時，誘導MSCs發生自噬

3氧化應激微環境下，MSCs發生自噬對細胞起保護作用

MTT實驗結果說明，H2O2組的細胞活力抑制率較正常組明顯上升，H2O2+z-VAD組的細胞活力抑制率較H2O2組明顯下降，H2O2+3-MA組和H2O2+CQ組的細胞活力抑制率較H2O2組進一步上升，而H2O2+CQ+z-VAD組的細胞活力抑制率較H2O2+CQ組又有所下降(P<0.05)，見圖3。此外，H2o2組的細胞凋亡率較正常組明顯上升，H2O2+z-VAD組的細胞凋亡率較H2O2組明顯下降，H2O2+CQ組的細胞凋亡率較H2O2組進一步上升，而H2O2+CQ+z-VAD組的凋亡率較H2O2+CQ組又有所下降(P<0.05)。Westernblot技術檢測cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解變化顯示H2O2組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較正常組明顯上調；H2O2+z-VAD組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較H2O2組明顯下調，H2O2+CQ組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較H2O2組進一步上調，而H2O2+CQ+z-VAD組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較H2O2+CQ組又有所下調(P<0.05)。以上均提示H2O2誘導MSCs發生自噬對細胞存活起保護作用，細胞死亡是通過細胞凋亡(Ⅰ型程序性死亡)途徑而非過度自噬(Ⅱ型程序性死亡)途徑發生的，見圖4。

Figure3.TheeffectsofautophagicandapoptosisblockadecombinewithH2O2onthecellactivityofMSCsfor24h.Mean±SD. n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05 vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+CQ group.

圖3H2O2聯合自噬及凋亡抑制劑處理MSCs24h對細胞活力的影響

討論

與非糖尿病人相比，糖尿病患者其勃起功能障礙發病更早、患病率更高、程度也更嚴重，嚴重影響著患者的生活質量[1-2]。目前治療ED的一線藥物主要是PDEI5(如：西地那非、伐地那非、他達那非等)，但這類藥物可以引起一系列不良反應(如：頭痛、發熱、消化不良、腹瀉等)，且它對糖尿病性ED的療效遠低于非糖尿病患者[4]。

干細胞具有“高度增殖、自我更新和多向分化”的特性，在特定微環境下可定向分化為陰莖海綿體血管內皮細胞和平滑肌細胞[5]，因此人們希望通過移植MSCs來修復受損的陰莖血管內皮細胞和平滑肌細胞而到達治療ED的目的。無論是功能學測定還是組織學評價都顯示干細胞移植能夠改善勃起功能，但該作用僅維持7～28d后就逐漸消失，其原因與移植的干細胞無法適應受體的微環境而出現細胞過度凋亡有關[6-7]。因此，如何提高移植干細胞在受體內的存活率，是目前ED干細胞治療亟待解決的關鍵問題。

糖尿病高血糖導致機體處于高氧化應激狀態，這種狀態會損害陰莖海綿體神經和內皮細胞，nNOS和eNOS的活性降低，NO釋放減少，這是糖尿病ED的主要發病機制之一[3]。在鏈脲霉素誘導的糖尿病勃起功能障礙大鼠模型中，其陰莖海綿體內氧化應激產物如丙二醛等大量聚集，而抗氧化物質超氧化物歧化酶和谷胱甘肽含量明顯下降，不能有效清除ROS，導致糖尿病ED陰莖海綿體組織中ROS水平增加[14-15]。研究顯示，即使應用胰島素將血糖控制在正常范圍，因為線粒體的“代謝記憶”，即糖化的線粒體繼續產生過量ROS，這種高氧化應激狀態依然存在[16]。研究表明，ROS會影響骨髓間充質干細胞自我更新、分化，加速干細胞和內皮祖細胞衰老，增加其凋亡，降低受損血管的自我修復能力[9]。

細胞自噬是一個降解細胞內受損的細胞器和蛋白質并為細胞增殖提供再利用原料的復雜過程，可在細胞處于內外界壓力(如氧化壓力、低氧、營養缺乏等環境)時幫助細胞度過難關，同時自噬對干細胞的自我更新及分化發揮重要的調節作用[17]。

研究表明氧化應激在誘導細胞凋亡的同時促進細胞自噬[18]，但氧化應激環境下自噬與凋亡的關系比較復雜，關于在糖尿病患者陰莖海綿體高氧化應激微環境中移植MSCs是否發生自噬、自噬與細胞存活及凋亡的關系，目前國內外尚未見文獻報道。本實驗用H2O2模擬高氧化應激微環境，探討體外MSCs在高氧化應激環境中凋亡及自噬水平的變化，并通過調節MSCs自噬水平，觀察其在氧化應激微環境下對MSCs增殖和凋亡的影響。首先，臺盼蘭計數法及MTT實驗測得細胞增殖率隨H2O2濃度上升逐漸下降。以酶原形式存在于胞漿中的caspase-3被激活生成活性片段cleavedcaspase-3以及PARP1 裂解被看作是細胞發生凋亡的標志之一。LC3存在胞漿可溶型LC3-Ⅰ和膜結合型LC3-Ⅱ 2種形式，當自噬被激活時，LC3-Ⅱ 隨自噬體膜的增多而增多，是自噬體的標志分子，因此LC3-Ⅱ 表達上調可作為細胞發生自噬的標志之一。P62是一個泛素結合蛋白，參與自噬過程并被降解，其表達下調可反映自噬活性增強[13]。本實驗發現，隨時間推移，LC3-Ⅱ、cleavedcaspase-3和cleavedPARP1的蛋白水平逐漸上調而P62逐漸下調，說明氧化應激微環境下細胞在發生凋亡的同時誘導自噬。“自噬潮”及透射電子顯微鏡實驗進一步證明氧化應激可誘導MSCs發生自噬。為探討在氧化應激微環境下細胞發生的自噬與凋亡的關系，本實驗結合MTT及流式細胞術發現H2O2抑制細胞增殖，增加細胞凋亡；阻斷自噬后細胞增殖進一步受抑制，凋亡率進一步上升，而凋亡抑制劑z-VAD能反轉這一結果。

Figure4.TheprotectiveeffectsofautophagyinducedbyH2O2ontheMSCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05 vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+CQ group.

圖4H2O2誘導MSCs自噬對細胞起保護作用

Westernblot實驗發現類似結果，H2O2能增加凋亡相關蛋白cleavedcaspase-3及cleavedPARP1的水平；阻斷自噬后，cleavedcaspase-3及cleavedPARP1進一步上調；而阻斷凋亡后，cleavedcaspase-3及cleavedPARP1明顯下調。以上結果均提示氧化應激引起MSCs死亡是通過凋亡途徑而非過渡自噬途徑實現的，其誘導的自噬對細胞起保護作用，但氧化應激誘導MSCs發生自噬的具體機制仍需要進一步探索。

綜上所述，氧化應激對MSCs存活具有雙重作用，在促進MSCs凋亡的同時還誘導保護性自噬，阻斷MSCs自噬可以顯著增加MSCs凋亡，因此進一步增強細胞保護性自噬可能有望提高移植MSCs在糖尿病高氧化應激微環境的存活率，從而改善移植MSCs對糖尿病勃起功能障礙的療效。本實驗的成功實施，將為移植MSCs治療DMED提供新的思路。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81200254)；山西省回國留學人員科研基金資助項目(No. 2014-033)；山西省研究生創新基金資助項目(No. 20133075)

Effectofoxidativestress-inducedautophagyonproliferationandapoptosisofMSCsLIUGuan-yu1, 2,HEWei-yang1, ZHU Xin1,YANGFan1, HUANG Xiao-long1, 2, YIN Hu-bin1, 2, GOU Xin1

(1DepartmentofUrinarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,2Chongqing Key Laboratory of Molecular Oncology and Epigenetics, Chongqing 400016, China. E-mail: gouxincq@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether oxidative stress is able to induce autophagy in mesenchymal stem cells (MSCs), and to explore the effects of autophagy on MSC proliferation and apoptosis under oxidative stress circumstance as well as the underlying mechanism for promoting the therapeutic effects of transplanted MSCs on treating diabetes mellitus erectile dysfunction (DMED). METHODS: Hydrogen peroxide (H2O2) was applied to simulate the oxidative stress circumstance. The effects of H2O2at concentration of 0, 50, 100, 200, 400 μmol/L on the viability of MSCs were tested by the method of Trypan blue exclusion and MTT assay respectively . The methods of MTT assay, Western blot and transmission electron microscope (TEM) were used to explore the effects of H2O2on MSC apoptosis and autophagy. RESULTS: The proliferation of MSCs was obviously inhibited by H2O2in a dose-dependent manner (P<0.01) and the 50% inhibiting concentration (IC50) was (384.58±16.89) μmol/L. H2O2induced apoptosis and autophay of MSCs. The proliferation rate of MSCs was suppressed by H2O2significantly (P<0.05), with a further decline by blockade of autophagy (P<0.05) whereas increased by blockade of apoptosis (P<0.05). H2O2induced MSCs apoptosis obviously (P<0.05), with an augment of apoptosis (P<0.05) by blockade of autophagy. Furthermore, the H2O2increased expression of cleaved caspase-3 and cleavage of poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), Which were decreased by apoptosis blockade whereas were enhanced by blockade of autopahgy. CONCLUSION: Oxidative stress plays a dual role in MSC survival, which induces MSC apoptosis and autophagy. Moreover, blockade of autophagy intensifies MSC apoptosis. Therefore, it is a promising method to ameliorate the effects of stem-cell based therapy on DMED by enhancing protective autophagy to increase the survival rate of transplanted MSCs against oxidative stress circumstance caused by diabetes mellitus.

[KEY WORDS]Autophagy; Mesenchymal stem cells; Cell proliferation; Apoptosis; Oxidative stress

通訊作者△Tel: 0351-4135787; E-mail: luli7300@126.com

[收稿日期]2015- 04- 30[修回日期] 2015- 09- 07

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2183- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.011

[中圖分類號]R363.2; R698+.1

[文獻標志碼]A