LMNA基因C.1583 C>G突變致Emery-Dreifuss型肌營養不良2個家系心臟受累特點研究

張　麗，張利宣，張素華，王　靜，丁　芳(河北醫科大學第三醫院干部病房，河北 石家莊 050051)

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·論著·

LMNA基因C.1583 C>G突變致Emery-Dreifuss型肌營養不良2個家系心臟受累特點研究

張麗，張利宣*，張素華，王靜，丁芳(河北醫科大學第三醫院干部病房，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的分析LMNA基因C.1583 C>G突變致2個Emery-Dreifuss型肌營養不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，EDMD)家系心臟受累特點。方法收集、分析2例先證者及其家系臨床資料及血液標本(提取DNA)，以及2例先證者活組織檢查骨骼肌病理分析；PCR、直接測序；3例患者進行心電圖、超聲心動圖、99TcM-MIBI門控心肌灌注顯像檢查。結果家系1呈常染色體顯性遺傳，家系2為散發病例；3例患者均具有典型的EDMD臨床表現：關節攣縮，進行性加重肌無力、肌萎縮，心律失常伴或不伴心肌病；活組織檢查骨骼肌病理分析呈肌病改變；基因檢測家系1(2例患者)、家系2(1例患者)LMNA基因9號外顯子C.1583C>G(T528R)雜合錯義突變；心電圖及心臟影像學檢查顯示3例患者表現不同程度及類型的心律失常：竇性心動過速、心房撲動、Ⅲ度房室傳導阻滯；家系2先證者合并心肌病，家系1先證者合并擴張型心肌病、心力衰竭；家系1先證者女兒無明顯心臟結構功能異常。結論2個家系3例患者經臨床、活組織檢查骨骼肌病理分析、基因檢測確診為EDMD，致病基因均為LMNA基因9號外顯子C.1583C>G(T528R)雜合錯義突變；LMNA基因突變所致EDMD心臟受累程度更嚴重，心臟傳導系統受累常合并擴張型心肌病和(或)心力衰竭。

[關鍵詞]肌營養不良,Emery-Dreifuss型；心臟病；突變

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.01.002

Emery-Dreifuss型肌營養不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，EDMD)是一組進行性肌營養不良，臨床表現為早期關節攣縮、進行性加重的肌無力和肌萎縮、心臟受累三聯征(包括X連鎖遺傳、常染色體顯性遺傳及常染色體隱性遺傳3種遺傳方式)[1]。心臟受累是EDMD患者猝死的首要原因，關注EDMD患者的心臟受累，早診斷，早治療，定期隨訪，能夠延長患者壽命，改善患者的生存質量[2]。常染色體遺傳最常見的致病基因為LMNA基因[3]，該基因突變所致常染色體顯性遺傳EDMD(autosomal dominant EDMD，AD-EDMD)，心臟受累程度較其他類型EDMD更嚴重，而目前對LMNA基因突變所致EDMD心臟受累報道較少。本研究報道分析了攜帶LMNA基因錯義突變的2個EDMD家系心臟受累特點。

1資料與方法

1.1一般資料收集2006年10月—2013年9月河北醫科大學第三醫院神經肌肉病科家系1先證者、家系1先證者女兒和家系2先證者(3例患者)以及所屬2個家系的臨床資料，進行詳細的家系調查。

本研究已獲得醫院醫學倫理委員會批準。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2活組織檢查骨骼肌病理分析局部浸潤麻醉下，行開放式左肱二頭肌活組織檢查，快速異戊烷/液氮冷凍，-80 ℃保存，恒冷切片機7 μm切片，組織化學及抗Emerin、LaminA/C單克隆抗體免疫熒光染色，病理分析。

1.3心臟評估常規進行12導聯心電圖(electrocardiogram，ECG)、經胸二維超聲心動圖檢查(ultrasonic cardiogram，UCG)及99TcM-MIBI門控心肌灌注顯像(99TcM-MIBI gated myocardial perfusion imaging,99TcM-MIBI GPI)。

1.4基因分析

1.4.1DNA標本獲得3例患者及家系成員采集靜脈血3 mL，天根試劑盒提取全血DNA，-20 ℃保存，用于基因分析。

1.4.2引物設計參照人類基因組數據庫Genebank 提供的LMNA基因序列，應用Primer Premier 5.0引物設計軟件，覆蓋LMNA基因全長，分別包括12個外顯子及內含子交界區。

1.4.3LMNA基因PCR50μL，高壓雙蒸水32 μL,10×緩沖液5 μL，dNTP(100 mg/L)4 μL，Takara Hotstar Taq PCR 反應目的片段擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳產物分離鑒定，PCR 產物純化ABI-377自動測序儀測序，應用Sequencher 4.90 軟件測序結果與LMNA正常人類基因組參照序列進行比對分析,家系成員重復相關突變基因位點檢測。

2結果

2.1臨床特點家系1呈常染色體顯性遺傳，家系2為散發病例。家系1先證者女兒血肌酸激酶(creatine kinase CK)輕度升高，其余患者血CK檢查結果正常。3例患者肌電圖檢查均提示肌源性改變。臨床資料見表1，家譜圖見圖1。

表1　2個EDMD家系3例患者臨床資料

圖1家譜圖

A.家系1：箭頭指示的是先證者，黑色符號表示患者，白色符號代表健康個體；B.家系2：箭頭指示的是先證者，黑色符號表示患者，白色符號代表健康個體

Figrure 1Pedigree of two families examined in the study

2.2活組織檢查骨骼肌病理HE染色示肌纖維大小不一，變性、壞死和再生肌纖維散在，可見輕度核內移及肌纖維分裂，結締組織增生；COX染色部分肌纖維酶活性缺失或減低；ATP染色(pH=4.65)，選擇性Ⅱ型肌纖維優勢(家系1先證者)，選擇性Ⅰ型肌纖維優勢(家系1先證者女兒、家系2先證者)；萎縮肌纖維有成小群趨勢；抗Emerin、laminA/C免疫熒光染色正常(圖2)。

圖2活組織檢查骨骼肌病理分析

A.呈散在肌纖維變性，壞死，再生，結締組織增生(HE ×100)；B.Ⅰ型肌纖維優勢(ATP染色 ×100)；C.肌纖維核膜抗Emerin單克隆抗體正常著色(免疫熒光染色 ×100)；D.肌纖維核膜抗Lamin A/C單克隆抗體正常著色(免疫熒光染色 ×100)

Figrure 2Representative histopathological analysis of muscle biopsies from patient 1 with Emery-Dreifuss muscular dystrophy

2.3心臟評估家系1先證者，出現心悸、胸悶、呼吸困難，心肺查體：叩診心界向左下擴大，心率 42次/min，節律規整，余未見明顯陽性體征；家系1先證者女兒，無心臟受累的臨床癥狀和體征；家系2先證者，出現心悸、一過性黑矇臨床表現，心肺查體：心率 58次/min，節律不整，余無明顯異常體征。

2.3.1ECG檢查家系1先證者：Ⅲ度房室傳導阻滯，室性逸搏；家系1先證者女兒：竇性心動過速；家系2先證者：心房撲動、P′波與QRS波動比例2~4∶1下傳(圖3)。

2.3.2心臟影像學檢查家系1先證者：UCG示全心增大、二三尖瓣少量反流、左心室舒張功能減低，左心室射血分數減低(45%)；99TcM-MIBI GPI示左心室腔增大，左心室壁心肌呈“花斑樣”改變。家系1先證者女兒：UCG及99TcM-MIBI GPI未見異常。家系2先證者：UCG檢查未見明顯異常，99TcM-MIBI GPI示左心室前壁中段血流灌注減低(圖3)。

圖3 患者1、2、3ECG、99TcM-MIBIGPI表現A.患者1ECG表現為完全性房室傳導阻滯;B.患者2ECG表現為竇性心動過速;C.患者3ECG表現為心房撲動;D.患者199TcM-MIBIGPI顯示左心室心肌花斑樣改變;E.患者299TcM-MIBIGPI顯示正常;F.患者399TcM-MIBIGPI顯示左心室心尖部心肌灌注減低Figure3 ECG,99TcM-MIBIGPItracesofpatients1,2and3

2.4基因檢測家系1先證者及其女兒基因檢測結果：LMNA基因9號外顯子C.1583 C>G(T528R)雜合錯義突變，家系中其他7人無該突變位點。家系2先證者基因檢測結果：LMNA基因9號外顯子C.1583 C>G(T528R)雜合錯義突變，家系中其他5人無該突變位點(圖4)。

圖4LMNA基因測序圖：LMNA基因9號外顯子C.1583 C>G(T528R)突變

Figure 4Chromatograms of the heterozygous C.1583 C>G(T528R) mutation in exon 9 ofLMNA

3討論

LMNA基因定位于染色體1q21，由12個外顯子組成，由于剪接部位的不同，可轉錄為2種不同的mRNA，分別編碼相對分子質量為74 000的LaminA和64 000的LaminC[3]。LaminA/C是V型中間絲蛋白家族成員(中部由7個重復的疏水氨基酸序列組成α-螺旋桿狀區域,兩端由球狀的氨基端和羧基端組成)，位于細胞核纖層內，廣泛表達于骨骼肌、心肌、脂肪、血管、皮膚、神經組織，具有多種功能，包括調控細胞核的生長和形狀、DNA復制、染色質形成、RNA剪切、細胞分化、凋亡及信號轉導等[4]。

本研究結果顯示，家系1呈常染色體顯性遺傳，家系2為散發病例，2個家系的先證者及患者符合EDMD的典型臨床特征：早期肩、肘、踝關節攣縮；緩慢進展的肌無力和肌萎縮呈肱-腓分布,隨病情進展,逐漸擴展到腰帶肌、脊柱旁肌。3例患者活組織檢查骨骼肌組織化學染色可見少量變性、壞死和再生肌纖維，結締組織增生，提示肌營養不良改變；Emerin及LaminA/C單克隆抗體免疫熒光染色均正常。EDMD活組織檢查骨骼肌病理像缺乏特異性，因此不能作為確診依據，EDMD的明確診斷需基因分析。

本研究基因檢測家系1先證者及其女兒、家系2先證者LMNA基因9號外顯子發現同一C.1583 C>G雜合錯義突變，導致第528個氨基酸由蘇氨酸替換為精氨酸(T528R)，該基因變異與意大利和德國學者的報道一致[5-6]，提示該突變可能無種族差異，且有較高的發生率。有學者報道AD-EDMD患者新生突變(散發病例)發生率較高，約為76%[7]，家系2中僅先證者出現了LMNA基因突變，提示該患者為新生突變致病。

心臟傳導系統受累為EDMD患者最嚴重的并發癥，其受累程度與骨骼肌無力的嚴重程度無相關性，與年齡及病程呈正相關[8]。心律失常的特征性表現為進行性加重的竇房結功能減低和(或)房室傳導阻滯；發病率最高的是心房顫動、心房撲動等室上性快速性心律失常，伴或不伴有束支阻滯；其次為房室傳導阻滯；部分患者可出現室性心動過速、心室顫動等惡性心律失常，是患者猝死的首要原因[8]。本研究患者出現了不同程度及類型的心律失常，與年齡呈正相關：家系1先證者女兒(12歲)，年齡最小，心臟受累程度最輕，僅表現為竇性心動過速；家系2先證者(24歲)，表現為心房撲動，提示竇房結功能減退；家系1先證者(33歲)，心臟受累程度最重，出現房室傳導阻滯及室性逸搏，提示傳導系統嚴重受損。

LMNA基因突變所致AD-EDMD心臟受累程度較其他類型EDMD更嚴重，除傳導系統受累外，常伴有擴張型心肌病、左心室功能減退或心力衰竭，活組織檢查心肌病理分析可見大量心肌細胞變性、壞死、顯著心肌纖維化和脂肪浸潤[8-9]。心臟影像學檢查(UCG及99TcM-MIBI GPI)：家系2先證者左心室前壁中段血流灌注減低，提示合并心肌病；家系1先證者心腔擴大，左心室舒縮功能減低，左心室壁心肌灌注嚴重缺損，提示合并擴張型心肌病及心力

衰竭；家系1先證者女兒心臟瓣膜結構及功能未見明顯異常，心臟受累程度較輕，考慮與年齡較小、病程較短有關，需進一步隨訪觀察病情變化。LMNA基因突變影響LaminA/C蛋白中央“桿”狀功能區，為擴張型心肌病的主要發病機制。本研究中，第528位蘇氨酸位于氨基酸序列球形尾部區域高度保守的序列，該氨基酸突變對蛋白中央“桿”狀功能區影響不大，通過引起球狀功能區正常結構破壞導致蛋白LaminA/C穩定性降低[10]。最近有研究報道了R541H突變所致EDMD心臟受累表型嚴重，猝死發生率高，兒童期即需要心臟移植。蛋白功能分析發現R541H突變主要影響LaminA/C蛋白兩端球狀功能區的結構穩定性，導致較嚴重的心臟臨床表型[3]。本研究研究結果與之一致[11-12]。

本研究2個家系3例患者經臨床、活組織檢查骨骼肌病理分析、基因檢測確診為EDMD，致病基因均為LMNA基因9號外顯子C.1583 C>G(T528R)雜合錯義突變；LMNA基因突變所致EDMD心臟受累程度較其他類型EDMD更嚴重，常合并擴張型心肌病和(或)心力衰竭，心臟受累與年齡及病程呈正相關。

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(本文編輯：趙麗潔)

Cardiac effects of the C.1583 C>GLMNAmutation in two families

with Emery-Dreifuss muscular dystrophy

ZHANG Li，ZHANG Li-xuan*，ZHANG Su-hua，WANG Jing，DING Fang

(Department of Geriatric Diseases，the Third Hospital of Hebei Medical

University，Shijiazhuang 050051，China)

[Abstract]ObjectiveTo report and analyze cardiac involvement in two Emery-Dreifuss muscular dystrophy(EDMD) pedigrees caused by C.1583 C>G mutation of the lamin A/C gene(LMNA).MethodsThe characteristics of members of two families with EDMD were evaluated clinically,pathologically and genetically.Skeletal muscle biopsies and pathological analysis were performed in two probands.Electrocardiogram,ultrasound cardiography and99TcM-MIBI-gated myocardiac perfusion imaging(99TcM-MIBI GPI) were performed on three patients.ResultsFamily history investigations revealed an autosomal dominant transmission pattern of disease in family 1,and a sporadic case in family 2.Three affected patients all presented typical clinical features of EDMD including joint contracture,muscle weakness,and cardiac involvement.Muscle histopathological study revealed dystrophic features.Moreover,each affected individual presented with cardiac arrhythmia,evident as sinus tachycardia,atrial flutter,or complete atrioventricular block.Cardiac imaging study showed dilated cardiomyopathy in two patients,one of whom was undergoing heart failure,the second patient had no obvious abnormalities in cardiac structure or function.All three affected individuals had a heterozygous missense mutation inLMNAgene(C.1583 C>G) ,which caused a T528R amino acid change inLMNAprotein.ConclusionThree patients were identified with EDMD,clinically,pathologically and genetically.Causative gene was missense mutation C.1583 C>G ofLMNA.EDMD caused by mutation ofLMNApresented more severe cardiac involvement,complicated with cardiac conduction system defect,cardiomyopathy and/or heart failure.

[Key words]muscular dystrophy,Emery-Dreifuss；heart diseases；mutation

[中圖分類號]R746.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)01-0005-05

*通訊作者

[作者簡介]張麗(1981-)，女，河北衡水人，河北醫科大學第三

[基金項目]河北省醫學科學研究重點課題(20150274)

[收稿日期]2015-08-17；[修回日期]2015-09-15

醫院主治醫師，醫學博士，從事老年病及遺傳病診治研究。