間充質干細胞旁分泌效應在缺氧缺血性腦損傷中的應用

劉慧娟，戴王娟，康樹敏，蔣犁

(東南大學附屬中大醫院 兒科，江蘇 南京　210009)

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間充質干細胞旁分泌效應在缺氧缺血性腦損傷中的應用

劉慧娟，戴王娟，康樹敏，蔣犁

(東南大學附屬中大醫院 兒科，江蘇 南京210009)

[摘要]間充質干細胞(MSCs)旁分泌的生物活性因子廣泛參與免疫調節、神經炎癥反應、細胞增殖與凋亡、內源性前體細胞再生、血管再生等多種病理生理過程，MSCs旁分泌效應在在修復新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBI)過程中發揮重要的作用，有望成為治療HIBI優良的種子細胞。作者就MSCs旁分泌效應在修復缺氧缺血性腦損傷中的應用作一綜述。

[關鍵詞]間充質干細胞； 旁分泌； 新生兒； 缺氧缺血； 腦損傷； 文獻綜述

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBI)是新生兒腦損傷的主要形式[1]。腦損傷相關機制有小膠質細胞激活、神經炎癥反應、氧化應激、通過損傷相關分子模式(DAMPs)激活Toll樣受體[2- 3]。這些環節形成細胞網絡及細胞因子網絡，造成全腦損傷。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療腦損傷能減少腦損傷面積、促進神經功能恢復。作者對近年來MSCs通過旁分泌作用修復腦損傷的機制作一綜述，為MSCs移植治療HIBI提供實驗依據。

1MSCs分泌的生物活性因子及MSCs移植治療HIBI的現狀

MSCs在體外易分離培養、擴增，同種異體移植后免疫原性低，可以定向歸巢作用于腦損傷部位發揮作用[4- 5]，是理想的種子細胞。MSCs旁分泌的生物活性因子主要有：(1) 生長因子及其受體。包括血管內皮生長因子(VEGF)，血管生成素(Ang)1、2，腦源性神經營養因子(BDNF)，神經生長因子(NGF)，轉化生長因子-β(TGF-β)，表皮生長因子及VEGF受體- 1(VEGFR- 1)等。(2) 細胞因子和趨化因子。包括白細胞介素- 10(IL- 10)、白細胞介素- 1(IL- 1)、腫瘤壞死因子(TNF)及趨化因子等；(3)調節肽及其他活性因子，包括降鈣素、CXCR4等。這些因子在修復HIBI過程中發揮重要的作用。

研究MSCs移植治療HIBI主要集中在兩點：(1) 利用分化潛能在損傷區域直接分化代替受損細胞[6]；(2) 利用其分泌的多效細胞因子，發揮旁分泌作用，刺激內源性營養及修復機制的啟動[7]。當前研究已證實，MSCs替代損傷組織的可能性極小[8]。外源性MSCs主要參與免疫調節、神經炎癥反應、細胞增殖與凋亡、內源性前體細胞再生、血管再生等過程[9]。

2MSCs通過旁分泌作用修復HIBI的可能機制

2.1免疫調節與神經炎癥反應調控

小膠質細胞的激活在神經系統炎癥反應中起關鍵作用，被激活的小膠質細胞產生大量的神經毒性物質，如TNF-α、干擾素-γ、IL- 1β，活性氧/活性氮類和谷氨酸鹽等，形成級聯網絡，參與腦損傷的發生、發展[2]。研究發現，予以HIBI幼鼠移植MSCs治療后，腦組織的小膠質細胞數量較未移植組明顯下降，神經炎癥反應得到抑制，損傷面積減小，證明MSCs能對抗過度炎癥反應[10]；而且移植MSCs治療HIBI的模型組促炎因子TNF-α和IL- 1β含量比未移植組明顯降低[11]。對MSCs抗炎機制的認識主要有以下3種[12]：(1) MSCs被激活，表達IL- 1受體拮抗劑，阻礙IL- 1發揮作用。(2) 形成負反饋環路：TNF-α及其他炎癥細胞分泌的促炎因子刺激MSCs表達抗炎基因——TSG- 6，TSG- 6可負反饋抑制炎癥細胞NF-κB信號通路，阻止炎癥級聯反應的發生。研究已證實，NF-κB是與腦損傷密切相關的細胞內轉錄因子，其使效應細胞活化釋放促炎因子導致過度炎癥反應[3]。(3) 形成第2個負反饋環路：通過受損組織及巨噬細胞產生的TNF- α、NO和其他DAMPs激活MSCs分泌前列腺素E2，促使巨噬細胞從促炎的M1表型向抗炎的M2表型轉換，轉換表型后的巨噬細胞可分泌IL- 10，抑制炎癥反應。

MSCs可通過細胞間直接接觸及旁分泌效應抑制特異性和非特異性免疫，發揮調節作用[5]。有報道MSCs與免疫細胞共培養后，IL- 10等可溶性免疫調節因子生成增加[13]。研究證明，TNF- α/NF- κB信號通路在MSCs免疫調節功能中起到關鍵作用，激活TNF- α/NF- κB信號通路會介導MSCs的免疫抑制功能，而沉默NF- κB或TNF- α受體基因的表達后，MSCs免疫抑制能力消失[14]。

2.2抗凋亡作用

研究認為，繼發性神經元凋亡與激活caspase- 3引起級聯放大反應有關。對損傷反應進行適當干預可逆轉神經元的凋亡[15]。一項研究表明，在7日齡大鼠HIBI模型中，移植MSCs組在移植1 d后與未移植組相比，起細胞凋亡執行者作用的caspase- 3活性明顯降低，同時具有神經營養作用的BDNF基因上調，腦損傷區域成熟神經元數量顯著增多，說明處于凋亡邊緣的受損神經元凋亡明顯減少[16]。而將BDNF基因修飾的MSCs與單純MSCs分別移植HIBI模型大鼠后，發現前者的抗凋亡效果更佳[17]。另外，Kim等[18]研究發現，MSCs移植到HIBI模型后，TUNEL檢測顯示重度腦損傷部位的細胞凋亡受到抑制；MRI顯示病變程度減輕。

2.3促進內源性前體細胞再生

Yang等[19]研究發現，大腦存在內源性再生機制，缺血性腦損傷會刺激內源性神經干細胞的增殖和分化，但再生作用較為局限。Van Velthoven等[10]將MSCs經腦室移植到3日齡的HIBI模型小鼠后，大腦病變半球中BrdU陽性細胞數量增加，海馬區和皮層新近分裂的神經元和少突膠質細胞數量亦有所增加，而檢測發現外源性MSCs增殖率不足1%。說明近期分裂的細胞并非來自外源性MSCs。MSCs移植治療21 d后，神經元、少突膠質細胞丟失分別減少了42%和31%，腦損傷面積顯著減少，運動功能及發育狀況明顯改善。研究認為，移植MSCs主要是通過分泌多種營養因子刺激內源性干細胞增殖和分化、增強軸突可塑性并加強神經元之間的信號傳遞來促進損傷修復的。此外，有實驗對單劑量和重復劑量移植MSCs治療HIBI小鼠的效果進行研究比較，發現單次移植MSCs存活數量非常有限，而重復移植MSCs對促進皮質脊髓束重建的效果較為明顯；檢測發現，在重復劑量移植MSCs組，與神經系統發育、神經再生、軸突生長相關的基因上調明顯[7]。新的研究表明，MSCs也可通過音猬因子信號通路介導內源性神經干細胞的增殖[20]，進一步證實外源性MSCs可通過旁分泌效應誘導腦中內微環境變化以促進內源性細胞增殖、分化,修復損傷。

2.4促進血管再生，改善組織灌流

應用干細胞治療缺氧缺血腦損傷(HI)模型大鼠發現，與血管生成密切相關的VEGF及VEGF mRNA含量明顯增多，同時閉合蛋白含量增加，其中VEGF含量是未移植組的4倍。這些因子共同參與損傷部位血管再生、重建，改善受損區域血供、增加氧和營養物質的供給[16]。CXCR4/SDF- 1α軸在MSCs旁分泌VEGF過程中也發揮重要作用，MSCs過表達CXCR4(MSCsCXCR4)聯合SDF- 1α通過激活MSCs內Akt信號通路可以促進VEGF分泌。體外將MSCsCXCR4聯合SDF- 1α與靜脈內皮細胞共培養發現，MSCsCXCR4分泌的VEGF通過激活內皮細胞上的VEGF受體2及其下游信號通路發揮其生物學功能。后期在體實驗將MSCsCXCR4移植到腦損傷小鼠體內，21 d后損傷部位有廣泛的血管重建和血流灌注，這說明MSCsCXCR4旁分泌的VEGF對促進腦損傷后血管重建發揮了重要作

用[21]。

2.5趨化作用

有實驗研究比較人神經前體細胞與人臍帶血MSCs分泌譜發現，后者趨化因子CCL2、CCL7及CXCL1、CXCL8高表達(P<0.01)。將MSCs移植入7日齡HI模型大鼠，7 d后移植細胞仍然表達CCL3及CXCL1。同時移植MSCs組腦損傷區域的巢蛋白標記的細胞數量增加，MRI顯示腦梗死面積減少，說明腦損傷早期趨化因子能誘導神經祖細胞向損傷區遷徙，促進損傷的修復[22]。

3總結與展望

綜上所述，MSCs移植有望成為治療HIBI的有效方案。但目前仍有許多問題尚未解決，如修復病變的機制仍不明，MSCs的來源和數量、移植途徑、移植時間窗及移植后長期安全性、有效性等尚無明確標準。在這些問題未得到妥善的解決之前，MSCs廣泛應用于臨床仍然任重而道遠。

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doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.029

[中圖分類號]R722.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0257- 03

[通信作者]蔣犁E- mail:jiangli77777@126.com

[作者簡介]劉慧娟(1989-)，女，安徽阜陽人，在讀碩士研究生。E- mail：huijuanliu9@163.com

[基金項目]國家自然科學基金(81370739)；江蘇省自然科學基金(BK20131303)

[收稿日期]2015- 11- 24[修回日期] 2015- 12- 23

[引文格式] 劉慧娟，戴王娟，康樹敏，等.間充質干細胞旁分泌效應在缺氧缺血性腦損傷中的應用[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(2)：257- 259.

·綜述·