間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在缺氧缺血性腦損傷中的應(yīng)用

劉慧娟，戴王娟，康樹敏，蔣犁

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 兒科，江蘇 南京　210009)

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間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在缺氧缺血性腦損傷中的應(yīng)用

劉慧娟，戴王娟，康樹敏，蔣犁

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 兒科，江蘇 南京210009)

[摘要]間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)旁分泌的生物活性因子廣泛參與免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、內(nèi)源性前體細(xì)胞再生、血管再生等多種病理生理過(guò)程，MSCs旁分泌效應(yīng)在在修復(fù)新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBI)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，有望成為治療HIBI優(yōu)良的種子細(xì)胞。作者就MSCs旁分泌效應(yīng)在修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的應(yīng)用作一綜述。

[關(guān)鍵詞]間充質(zhì)干細(xì)胞； 旁分泌； 新生兒； 缺氧缺血； 腦損傷； 文獻(xiàn)綜述

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBI)是新生兒腦損傷的主要形式[1]。腦損傷相關(guān)機(jī)制有小膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、通過(guò)損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)激活Toll樣受體[2- 3]。這些環(huán)節(jié)形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，造成全腦損傷。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療腦損傷能減少腦損傷面積、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。作者對(duì)近年來(lái)MSCs通過(guò)旁分泌作用修復(fù)腦損傷的機(jī)制作一綜述，為MSCs移植治療HIBI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1MSCs分泌的生物活性因子及MSCs移植治療HIBI的現(xiàn)狀

MSCs在體外易分離培養(yǎng)、擴(kuò)增，同種異體移植后免疫原性低，可以定向歸巢作用于腦損傷部位發(fā)揮作用[4- 5]，是理想的種子細(xì)胞。MSCs旁分泌的生物活性因子主要有：(1) 生長(zhǎng)因子及其受體。包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，血管生成素(Ang)1、2，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，表皮生長(zhǎng)因子及VEGF受體- 1(VEGFR- 1)等。(2) 細(xì)胞因子和趨化因子。包括白細(xì)胞介素- 10(IL- 10)、白細(xì)胞介素- 1(IL- 1)、腫瘤壞死因子(TNF)及趨化因子等；(3)調(diào)節(jié)肽及其他活性因子，包括降鈣素、CXCR4等。這些因子在修復(fù)HIBI過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

研究MSCs移植治療HIBI主要集中在兩點(diǎn)：(1) 利用分化潛能在損傷區(qū)域直接分化代替受損細(xì)胞[6]；(2) 利用其分泌的多效細(xì)胞因子，發(fā)揮旁分泌作用，刺激內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)及修復(fù)機(jī)制的啟動(dòng)[7]。當(dāng)前研究已證實(shí)，MSCs替代損傷組織的可能性極小[8]。外源性MSCs主要參與免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、內(nèi)源性前體細(xì)胞再生、血管再生等過(guò)程[9]。

2MSCs通過(guò)旁分泌作用修復(fù)HIBI的可能機(jī)制

2.1免疫調(diào)節(jié)與神經(jīng)炎癥反應(yīng)調(diào)控

小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)，如TNF-α、干擾素-γ、IL- 1β，活性氧/活性氮類和谷氨酸鹽等，形成級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，參與腦損傷的發(fā)生、發(fā)展[2]。研究發(fā)現(xiàn)，予以HIBI幼鼠移植MSCs治療后，腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較未移植組明顯下降，神經(jīng)炎癥反應(yīng)得到抑制，損傷面積減小，證明MSCs能對(duì)抗過(guò)度炎癥反應(yīng)[10]；而且移植MSCs治療HIBI的模型組促炎因子TNF-α和IL- 1β含量比未移植組明顯降低[11]。對(duì)MSCs抗炎機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要有以下3種[12]：(1) MSCs被激活，表達(dá)IL- 1受體拮抗劑，阻礙IL- 1發(fā)揮作用。(2) 形成負(fù)反饋環(huán)路：TNF-α及其他炎癥細(xì)胞分泌的促炎因子刺激MSCs表達(dá)抗炎基因——TSG- 6，TSG- 6可負(fù)反饋抑制炎癥細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，阻止炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。研究已證實(shí)，NF-κB是與腦損傷密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其使效應(yīng)細(xì)胞活化釋放促炎因子導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)[3]。(3) 形成第2個(gè)負(fù)反饋環(huán)路：通過(guò)受損組織及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF- α、NO和其他DAMPs激活MSCs分泌前列腺素E2，促使巨噬細(xì)胞從促炎的M1表型向抗炎的M2表型轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換表型后的巨噬細(xì)胞可分泌IL- 10，抑制炎癥反應(yīng)。

MSCs可通過(guò)細(xì)胞間直接接觸及旁分泌效應(yīng)抑制特異性和非特異性免疫，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。有報(bào)道MSCs與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL- 10等可溶性免疫調(diào)節(jié)因子生成增加[13]。研究證明，TNF- α/NF- κB信號(hào)通路在MSCs免疫調(diào)節(jié)功能中起到關(guān)鍵作用，激活TNF- α/NF- κB信號(hào)通路會(huì)介導(dǎo)MSCs的免疫抑制功能，而沉默NF- κB或TNF- α受體基因的表達(dá)后，MSCs免疫抑制能力消失[14]。

2.2抗凋亡作用

研究認(rèn)為，繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡與激活caspase- 3引起級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)有關(guān)。對(duì)損傷反應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的凋亡[15]。一項(xiàng)研究表明，在7日齡大鼠HIBI模型中，移植MSCs組在移植1 d后與未移植組相比，起細(xì)胞凋亡執(zhí)行者作用的caspase- 3活性明顯降低，同時(shí)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的BDNF基因上調(diào)，腦損傷區(qū)域成熟神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，說(shuō)明處于凋亡邊緣的受損神經(jīng)元凋亡明顯減少[16]。而將BDNF基因修飾的MSCs與單純MSCs分別移植HIBI模型大鼠后，發(fā)現(xiàn)前者的抗凋亡效果更佳[17]。另外，Kim等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植到HIBI模型后，TUNEL檢測(cè)顯示重度腦損傷部位的細(xì)胞凋亡受到抑制；MRI顯示病變程度減輕。

2.3促進(jìn)內(nèi)源性前體細(xì)胞再生

Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，大腦存在內(nèi)源性再生機(jī)制，缺血性腦損傷會(huì)刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，但再生作用較為局限。Van Velthoven等[10]將MSCs經(jīng)腦室移植到3日齡的HIBI模型小鼠后，大腦病變半球中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，海馬區(qū)和皮層新近分裂的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量亦有所增加，而檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性MSCs增殖率不足1%。說(shuō)明近期分裂的細(xì)胞并非來(lái)自外源性MSCs。MSCs移植治療21 d后，神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失分別減少了42%和31%，腦損傷面積顯著減少，運(yùn)動(dòng)功能及發(fā)育狀況明顯改善。研究認(rèn)為，移植MSCs主要是通過(guò)分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子刺激內(nèi)源性干細(xì)胞增殖和分化、增強(qiáng)軸突可塑性并加強(qiáng)神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞來(lái)促進(jìn)損傷修復(fù)的。此外，有實(shí)驗(yàn)對(duì)單劑量和重復(fù)劑量移植MSCs治療HIBI小鼠的效果進(jìn)行研究比較，發(fā)現(xiàn)單次移植MSCs存活數(shù)量非常有限，而重復(fù)移植MSCs對(duì)促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束重建的效果較為明顯；檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在重復(fù)劑量移植MSCs組，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)再生、軸突生長(zhǎng)相關(guān)的基因上調(diào)明顯[7]。新的研究表明，MSCs也可通過(guò)音猬因子信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[20]，進(jìn)一步證實(shí)外源性MSCs可通過(guò)旁分泌效應(yīng)誘導(dǎo)腦中內(nèi)微環(huán)境變化以促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞增殖、分化,修復(fù)損傷。

2.4促進(jìn)血管再生，改善組織灌流

應(yīng)用干細(xì)胞治療缺氧缺血腦損傷(HI)模型大鼠發(fā)現(xiàn)，與血管生成密切相關(guān)的VEGF及VEGF mRNA含量明顯增多，同時(shí)閉合蛋白含量增加，其中VEGF含量是未移植組的4倍。這些因子共同參與損傷部位血管再生、重建，改善受損區(qū)域血供、增加氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給[16]。CXCR4/SDF- 1α軸在MSCs旁分泌VEGF過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，MSCs過(guò)表達(dá)CXCR4(MSCsCXCR4)聯(lián)合SDF- 1α通過(guò)激活MSCs內(nèi)Akt信號(hào)通路可以促進(jìn)VEGF分泌。體外將MSCsCXCR4聯(lián)合SDF- 1α與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，MSCsCXCR4分泌的VEGF通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體2及其下游信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)功能。后期在體實(shí)驗(yàn)將MSCsCXCR4移植到腦損傷小鼠體內(nèi)，21 d后損傷部位有廣泛的血管重建和血流灌注，這說(shuō)明MSCsCXCR4旁分泌的VEGF對(duì)促進(jìn)腦損傷后血管重建發(fā)揮了重要作

用[21]。

2.5趨化作用

有實(shí)驗(yàn)研究比較人神經(jīng)前體細(xì)胞與人臍帶血MSCs分泌譜發(fā)現(xiàn)，后者趨化因子CCL2、CCL7及CXCL1、CXCL8高表達(dá)(P<0.01)。將MSCs移植入7日齡HI模型大鼠，7 d后移植細(xì)胞仍然表達(dá)CCL3及CXCL1。同時(shí)移植MSCs組腦損傷區(qū)域的巢蛋白標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量增加，MRI顯示腦梗死面積減少，說(shuō)明腦損傷早期趨化因子能誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞向損傷區(qū)遷徙，促進(jìn)損傷的修復(fù)[22]。

3總結(jié)與展望

綜上所述，MSCs移植有望成為治療HIBI的有效方案。但目前仍有許多問(wèn)題尚未解決，如修復(fù)病變的機(jī)制仍不明，MSCs的來(lái)源和數(shù)量、移植途徑、移植時(shí)間窗及移植后長(zhǎng)期安全性、有效性等尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)。在這些問(wèn)題未得到妥善的解決之前，MSCs廣泛應(yīng)用于臨床仍然任重而道遠(yuǎn)。

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doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.029

[中圖分類號(hào)]R722.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)02- 0257- 03

[通信作者]蔣犁E- mail:jiangli77777@126.com

[作者簡(jiǎn)介]劉慧娟(1989-)，女，安徽阜陽(yáng)人，在讀碩士研究生。E- mail：huijuanliu9@163.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81370739)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131303)

[收稿日期]2015- 11- 24[修回日期] 2015- 12- 23

[引文格式] 劉慧娟，戴王娟，康樹敏，等.間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在缺氧缺血性腦損傷中的應(yīng)用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(2)：257- 259.

·綜述·