miRNA與缺血性腦卒中關系的研究進展*

田燦輝 綜述，周　亮審校

(南方醫科大學附屬南方醫院神經內科，廣州 510515)

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miRNA與缺血性腦卒中關系的研究進展*

田燦輝 綜述，周亮△審校

(南方醫科大學附屬南方醫院神經內科，廣州 510515)

[關鍵詞]miRNA；缺血性腦卒中；動脈粥樣硬化；細胞凋亡；腦水腫

腦卒中是全球重大公共衛生問題，在世界范圍內腦卒中是第二死亡疾病[1]和第三致殘疾病[2]，給社會和個人造成了極大負擔。在我國，腦卒中已超過心血管疾病成為發病率、病死率和致殘率最高的疾病[3]。急性腦卒中構成中，大約80%屬于缺血性腦卒中。目前，重組人組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)溶栓治療是缺血性腦卒中超急性期最有效的治療手段，但狹窄的時間窗限制了其臨床應用。因此，從分子生物學的角度對缺血性腦卒中的發病機制進行深入研究，積極尋找有效的分子標志物和治療靶點，具有重要的臨床價值。

miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶mRNA的非翻譯區結合，在轉錄后水平調節基因表達。基于Sanger miRBase 21.0數據庫，目前已發現28 645條miRNA前體序列和35 828條成熟miRNA，共涵蓋223個物種，其中在人體中鑒別出1 881條miRNA前體序列和2 588條成熟miRNA。miRNA具有重要的生物學功能，參與調節生長發育、細胞增殖、分化、信號通路、新陳代謝和凋亡[4]。近年來，與缺血性腦卒中相關的miRNA研究取得了一定成果，本文將綜合近年來的研究報道，對miRNA與缺血性腦卒中的關系作一綜述。

1miRNA的生物合成與作用機制

miRNA的成熟是逐步生物合成的結果。細胞核內編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄成原始的miRNA轉錄本(pri-miRNA)；隨后被Drosha/DGCR8微處理器復合體加工形成具有莖環結構的長為60～70個核苷酸的前體miRNA(pre-miRNA)；細胞核內的pre-miRNA通過Ran-GTP依賴的核漿轉運蛋白Exportin 5輸出到細胞漿，在Dicer酶、Ago蛋白家族及RNA結合蛋白TRBP的共同作用下，產生約20個核苷酸長度的小分子雙鏈miRNA；隨后雙螺旋解鏈，其中一條單鏈迅速被降解，另一條單鏈(即成熟miRNA)結合到RNA誘導的沉默復合物(RISC)上形成miR-RISC復合物，通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(3′UTR)完全或不完全配對結合，降解靶mRNA或抑制其翻譯，進而發揮調控作用[5]。

2miRNA與缺血性腦卒中

缺血性腦卒中是一種急性起病的局灶性腦供血障礙性疾病，腦局部供血動脈血流灌注減少或完全中斷可引發該供血區腦組織崩解破壞，進而導致神經功能缺損。由缺血造成的復雜的級聯反應稱為“缺血瀑布”。已有大量的研究探索了生理條件和缺血性卒中后循環血和腦組織中miRNA的表達、分布及作用。研究顯示，眾多miRNA與腦組織發育、分化、生理功能及病變等密切相關，它們與靶基因共同參與炎癥、動脈粥樣硬化、神經血管再生、腦水腫形成、細胞凋亡、細胞外基質重塑等多種與缺血性卒中相關的病理生理學過程，提示miRNA可能成為缺血性卒中早期診斷的分子標志物和有效的治療靶標。

3miRNA與缺血性腦卒中細胞和動物實驗研究方面進展

神經細胞氧糖剝奪(OGD)模型，即將細胞更換無糖培養基，置于充以氮氣和二氧化碳混合氣體的低氧環境培養，是在細胞水平模擬腦組織缺血損傷的經典模型[6]。OGD致離體細胞缺血缺氧模型避免了諸多體內因素對實驗結果的干擾，便于觀察各種刺激的作用及進一步探索其分子生物學機制。

在動物研究方面，進展最迅速的是嚙齒類動物全腦或局灶性腦缺血模型。由于臨床上大腦中動脈供血區是缺血性腦卒中的多發部位，且大鼠與人類腦血管解剖較為相似，因此阻斷大腦中動脈(MCAO)形成的大鼠局灶性腦缺血模型被公認為是一種理想的動物模型。該模型成功率高，制備的缺血部位穩定可靠、重復性好，并能精確控制腦缺血和再灌注時間，因此受到國內外學者的高度重視，并廣泛應用于腦缺血的實驗研究中。

3.1動脈粥樣硬化(AS)途徑AS是缺血性腦卒中的主要病理生理基礎。業已證實，miRNA可以調節血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞的增殖、分化和功能，進而在AS的發生發展中起重要作用。

Sabatel等[7]研究體外血管生成發現，miRNA-21通過下調RhoB 的表達和活力，使內皮細胞遷移和管腔生成受限，發揮了負性調控血管生成的作用。研究證實，miRNA-92a可阻礙內皮細胞血管生成，抑制miRNA-92a有助于小鼠下肢缺血后的血管再生與功能恢復[8]。Iaconetti 等[9]進一步探討了miRNA-92a在血管損傷后的重塑作用。他們觀察到抑制miRNA-92a可促進內皮細胞的增殖和遷移，體內運用miRNA-92 拮抗劑顯著增強小鼠損傷頸動脈的再內皮化，減少球囊損傷或支架植入術后內膜新生，從而減少血管損傷后再狹窄。miRNA-126是一種內皮細胞特異性的miRNA，它通過調節內皮細胞對血管內皮生長因子的應答，下調炎性介質VCAM的表達，進而減少白細胞黏附和內皮炎癥反應，延緩AS進程[10]。此外，AS進程中內皮細胞凋亡可引起凋亡小體中miRNA-126釋放，它通過促進內皮修復可發揮抗AS的作用[11]。最近的一項研究顯示，miRNA-29c通過調節胰島素樣生長因子1信號通路，在人臍靜脈內皮細胞周期、增殖、遷移和血管生成方面起到重要的調控作用[12]。

Liu等[13]發現，血管壁中miRNA-221/222的功能是細胞特異性的，在血管平滑肌細胞中，miRNA-221/222具有促增殖、促遷移和抗凋亡的作用，在內皮細胞中其作用剛好相反，這可能與它們作用的靶基因不同有關。miRNA-143/145在平滑肌細胞中表達豐富，是調控其表型的分子開關[14]。缺乏miRNA-143/145的小鼠，其平滑肌維持在一種去分化的狀態，嚴重破壞血管平滑肌的穩態和功能[15]。miRNA-195 是另一種高表達于血管平滑肌細胞的miRNA。研究發現，miRNA-195可抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，下調促炎因子的合成，顯著減少損傷內膜新生血管形成[16]。Li等[17]研究表明，miRNA-663通過負向調控其下游轉錄因子Jun B和肌球蛋白輕鏈9的表達，調控人血管平滑肌細胞表型轉化，可作為治療血管增生性疾病的新靶標。另外，miRNA-23b可抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，轉錄因子FoxO4可能是miRNA-23b的直接靶標[18]。

在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下，單核巨噬細胞吸收脂質并引發炎癥反應，是AS發生、發展的關鍵。在oxLDL刺激的單核巨噬細胞中，miRNA-125a-5p、miRNA-9、miRNA-146a、miRNA-146b-5p、miRNA-155表達升高[19]。miRNAs通過調節相關轉錄因子信號通路調節巨噬細胞的分化和活力，進而調控AS的進程。

3.2細胞凋亡途徑Peng等[20]發現，miRNA-181b在MCAO模型小鼠和OGD模型N2a細胞中表達顯著下降，它反向調控熱休克蛋白A5和泛素C端水解酶L1的表達并誘導N2a細胞凋亡，下調miRNA-181b可減少MCAO大鼠大腦皮層神經元凋亡并改善神經功能。miRNA-124是重要的促凋亡因子，它可以結合到p53凋亡刺激蛋白家族ASPP抑制因子(iASPP)的3′UTR并抑制其蛋白表達。在MCAO模型小鼠中，注射miRNA-124可抑制顱內iASPP的表達誘導細胞凋亡，反之，下調miRNA-124將刺激iASPP的表達并顯著縮小梗塞體積[21]。miRNA-132是一種在神經元中特異表達的miRNA，在突觸發生和重構上起關鍵作用。研究顯示，在缺血后的大鼠海馬神經元中，REST基因的活化抑制了miRNA-132的表達，miRNA-132過表達可以大大減少缺血引起的神經元死亡[22]。Gubern等[23]研究證實，miRNA-347可引起MCAO大鼠皮質神經元凋亡，它可能通過上調Ascl4、Bnip3l和Phyhip的表達發揮作用。動物實驗發現，在缺血后的腦組織中miRNA-592表達下降，相應引起 p75NTR表達上升。上調神經元中miRNA-592表達可抑制缺血損傷引起的p75NTR的表達并抑制凋亡信號通路活化，減少神經元死亡[24]。miRNA-139-5p在大鼠大腦缺血缺氧模型中表達下降，且miRNA-139-5p與HGTD-P的表達呈負相關。miRNA-139-5p激動劑可以抑制神經元凋亡，從而減輕缺血缺氧腦損傷[25]。最近的一項研究顯示，卒中后miRNA-200c表達上升，它通過抑制reelin蛋白的表達加劇腦細胞死亡，提示下調卒中后miRNA-200c的表達是減輕卒中引起的腦損傷的潛在靶標[26]。

此外，miRNA-497、miRNA-223、miRNA-29c、miRNA-181a、miRNA-134等也可以通過調節缺血后神經元凋亡起到保護或加劇缺血損傷的作用。

3.3腦水腫損傷途徑水通道蛋白(AQP)是控制水進出細胞的一種蛋白質，腦水腫的形成與AQP-1和AQP-4的表達變化密切相關。Sepramaniam 等[27]研究表明，miRNA-320a前體可下調AQP1和AQP4的表達，在MCAO大鼠模型中注射miRNA-320抑制劑，可上調AQP-1和AQP-4在腦組織中的表達，從而縮小腦梗死體積，提示在缺血再灌注早期AQP表達增加可減輕腦水腫。進一步研究證實，miRNA-130a可顯著抑制AQP-4 M1基因啟動子的轉錄活性，體內研究發現，抑制miRNA-130a 的表達可上調腦組織中AQP4 M1的轉錄和蛋白表達，從而減輕腦水腫，縮小梗死體積并促進神經功能恢復。最新的一項研究表明，在MCAO大鼠中，腦組織和循環血中的miRNA-29b的表達均下降。通過促進miRNA-29b的表達可縮小梗死體積、減輕腦水腫并保護血腦屏障的完整性。雙熒光素酶檢測證實AQP-4是miRNA-29b的直接靶標[28]。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類作用于細胞外基質的蛋白水解酶，研究證實， MMP-9的早期表達與血腦屏障通透性的改變及腦水腫的發生、程度關系密切。miRNA-21和miRNA-181b通過作用于RECK和TIMP3基因調控MMP-9的表達，從而破壞血管基底膜，導致血腦屏障開放，進一步加重腦水腫形成。

4臨床試驗研究進展

Wang等[28]觀察了58例缺血性腦卒中患者，在起病后72 h內收集外周血樣本測定RNA水平，并在起病后3個月通過美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)和改良Rankin量表評估疾病的轉歸和預后。實驗結果顯示，與對照組相比，miRNA-29b在卒中患者中表達顯著下降，循環血中miRNA-29b的含量與卒中患者的NIHSS評分和腦梗死體積呈負相關。miRNA-29b含量高提示患者預后相對較好[28]。Huang等[29]收集了531例缺血性卒中患者，運用TaqMan assay方法研究hsa-miRNA-146a、 hsa-miRNA-196a2和hsa-miRNA-499多態性與中國人群缺血性卒中發病風險的關系。他們觀察到，miRNA-146a/rs2910164顯著增加中國人群缺血性卒中的發病風險，與空腹血糖和血脂水平共同在卒中的發生、發展中起到重要作用。另外，有一項納入了31例急性缺血性腦卒中的研究發現，卒中患者中miRNA-124和miRNA-9的表達均下降，卒中起病24 h內血清中miRNA-124和miRNA-9水平與梗死體積和血漿超敏C反應蛋白水平呈負相關，提示它們可能成為預測臨床轉歸和預后的新指標。Wang等[30]對79例缺血性卒中患者進行研究發現，卒中患者循環血中miRNA-223水平明顯上升，在大動脈粥樣硬化性卒中和小動脈閉塞性卒中升高更顯著。其含量與NIHSS評分和梗死體積呈負相關，它可能通過上調生長因子如IGF-1在卒中發生、發展中發揮作用。

5展望

近年來miRNA的研究受到越來越多的重視和關注，也取得了重大進展。隨著對miRNA認識的逐步深入，人們對于疾病的發生、發展有了進一步的認識。miRNA作為一類新型的調控分子，已經顯示出良好的臨床應用前景。它可以作為疾病早期診斷、分型、危險分層等方面的分子標志物，也可以通過補充外源性miRNA或者通過反義抑制寡核苷酸技術調控體內miRNA的表達，為疾病治療提供新的策略和手段。盡管miRNA與缺血性腦卒中的關系研究取得了一定的成果，但仍有大量問題有待更深入地研究，并以此為基礎將miRNA安全而有效地運用到缺血性腦卒中的早期診斷、疾病分型、個體化治療及預后評估等方面，使更多卒中患者受益。

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doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.040

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(NSFC81100882)。

作者簡介：田燦輝(1989-)，在讀博士，主要從事腦血管病的研究。△通訊作者，Tel:13711529698；E-mail:zhouliang_1963@126.com。

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2276-04

(收稿日期：2015-12-28修回日期：2016-03-26)