早期細胞凋亡引起活動期狼瘡小鼠的B細胞比例下降①

李寶輝　樊竑冶　劉　飛　任德善　侯亞義　周長林

(中國藥科大學生命科學與技術學院，南京210009)

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·臨床免疫學·

早期細胞凋亡引起活動期狼瘡小鼠的B細胞比例下降①

李寶輝樊竑冶劉飛②任德善②侯亞義②周長林

(中國藥科大學生命科學與技術學院，南京210009)

[摘要]目的：探索活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細胞數量的變化及其調節機制。方法：利用流式細胞儀，首先分析了18周齡活動期MRL/lpr狼瘡小鼠與正常C57/B6小鼠脾臟中B細胞的周期和B細胞占脾臟淋巴細胞的百分比；用Annexin V和PI標記方法檢測了B細胞及其亞類凋亡情況；進一步磁珠分選純化小鼠脾臟B細胞，實時定量 PCR方法檢測相關凋亡基因的表達變化。結果：與C57/B6小鼠相比，活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細胞比例明顯減少(P<0.01)，而凋亡比例顯著增加(P<0.01)，其中B細胞的早期凋亡比例增加(P<0.01)，而晚期凋亡未改變；凋亡的B細胞包括未成熟和成熟B細胞。進一步發現，活動期狼瘡小鼠B細胞中抗凋亡蛋白BIRC3明顯降低(P<0.01)，而促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加(P<0.01)。結論：活動期狼瘡小鼠B細胞的數目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，提示活動期SLE患者B細胞的減少可能與其早期凋亡相關。

[關鍵詞]B細胞；細胞凋亡；MRL/lpr狼瘡小鼠

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及全身多系統多器官的自身免疫性疾病，它以自身反應性T細胞和B細胞活化導致大量自身抗體的產生以及組織損傷為特征[1]。普遍認為，B細胞在SLE發病機制中發揮關鍵作用[2]。許多研究證實，SLE患者B細胞發生異常，且其活動期B細胞數量明顯減少[3,4]。可是一些研究報道，SLE患者中凋亡的細胞主要是T細胞[5]；活動期SLE患者的T細胞凋亡頻率明顯高于非活動期患者，且與病程密切相關，而B細胞凋亡不受疾病活動的影響[6]。可見，狼瘡活動期B細胞數量明顯減少是否與其凋亡相關仍有待闡明。

MRL/lpr小鼠是常用的狼瘡動物模型之一。MRL/lpr小鼠的癥狀與人類SLE相似。一般認為，MRL/lpr小鼠中含有與細胞凋亡有關的 Fas 基因隱性突變，導致 T細胞的死亡率降低和自身免疫反應加速[7,8]；MRL/lpr小鼠中Fas 基因突變不參與BCR誘導的成熟B細胞凋亡[9,10]。也研究發現Fas參與B細胞不同發育階段的正常凋亡過程[11]；MRL/lpr狼瘡小鼠中IFN-α上調死亡域相關蛋白6導致B淋巴細胞減少[12]。另外，有研究報道，活化誘導的B細胞凋亡在NZB/W F1狼瘡小鼠和 BALB/c小鼠之間是相似的，提示異常的細胞因子表達可能在NZB/W F1狼瘡小鼠的活化B細胞增殖中發揮了重要作用[13]。可是，至今對于活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細胞數量的變化及其調節機制不詳。因此，本研究探索活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細胞數量的變化及其調節機制，發現活動期狼瘡小鼠B細胞的數目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，提示活動期SLE患者B細胞的減少可能與其早期凋亡相關。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級正常C57/B6小鼠以及MRL/lpr狼瘡小鼠各10只，購自南京大學模式動物研究所。在南京大學醫院實驗動物SPF級動物室飼養后用于實驗。

1.1.2試劑與儀器FITC-anti-CD19、PE/Cy5-anti-CD138、PE-anti-IgM、APC-anti-IgD以及 isotype control 均購自eBioscience 公司；小鼠CD19+陽選磁珠購自Miltenyi公司； RPMI1640與胎牛血清培養基購自Gibco公司；qRT-PCR引物合成于Invitrogen公司；FACS calibur流式細胞儀為BD公司產品;實時定量PCR儀為ABI公司產品。

1.2方法

1.2.1無菌脾臟單個細胞懸液的制備脫頸椎處死小鼠，放入75%的酒精滅菌10 min；在超凈工作臺內取小鼠脾臟于無菌PBS中，用鑷子拉碎，200目的不銹鋼篩網過濾，除去組織和團塊；1 200 r/min離心5 min；加入預冷至4℃的紅細胞裂解液(ACK)，充分混勻振蕩，4℃靜置5 min；4℃ 1 200 r/min離心5 min，去上清；適量無菌PBS重懸。

1.2.2細胞周期和凋亡檢測收取懸浮的B細胞，70%乙醇4°C固定過夜。PBS洗去乙醇后，加入100 μl 含10 μg/ml PI(碘化丙啶)(Sigma公司)、0.2% Triton-100和2% RNase (Sigma)的染液，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后重懸于流式管，流式細胞儀(BD公司)檢測DNA含量，每樣收取至少20 000個細胞。ModFit軟件分析結果。細胞凋亡實驗用binding緩沖液重懸細胞于流式管，先后加入0.5 μl Annexin V-FITC試劑(BD公司)和2 μl 10 μg/ml PI染液，避光孵育10 min后，流式細胞儀檢測。

1.2.3B細胞的分離純化700 μl磁珠專用PBS重懸107個脾臟單個細胞，加入100 μl CD19+單抗偶聯的磁珠，混勻，4℃孵育15 min；5 ml磁珠專用PBS洗一次，4℃，1 200 r/min離心10 min，去上清；將上述磁珠和細胞的混合液對倍稀釋后，使用磁珠分離柱(LS)對細胞進行陽選，得到磁珠標記陽性的細胞群，即純化的小鼠脾臟B細胞。適量PBS重懸，PE標記的抗小鼠CD19單克隆抗體標記純化后的B細胞，流式細胞儀檢測B細胞純度。

1.2.4實時定量熒光PCR儀檢測B細胞中基因的表達收集B細胞，總RNA抽提按Trizol試劑(Invitrogen公司)說明書進行，提取的總RNA用紫外分光光度儀(Bio-Rad，USA)測A260。以GAPDH作為內參照，進行實時定量PCR，反應條件參照 FastStart Universal SYBR Green Master Real Time PCR Quantitation Kit提供的說明書操作。BIRC3、BCL2L1以及BBC3(PUMA)的相對表達水平用2-△Ct計算。

2結果

2.1活動期狼瘡機體中的B細胞周期中S期增加MRL/lpr小鼠是常用的狼瘡動物模型之一，在15至20周齡時出現顯著的血清自身抗體、免疫復合物腎小球腎炎、血管炎等表現。細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)及DNA合成后期(G2期)。我們利用流式細胞儀，首先分析了18周齡MRL/lpr小鼠的B細胞周期，結果表明，與同周齡的C57/B6小鼠相比，活動期MRL/lpr狼瘡小鼠B細胞的G1期和G2期沒有發生有意義的變化，但其S期B細胞的比例明顯增加(P<0.05)，見圖1。

2.2活動期狼瘡機體中的B細胞比例下降雖然許多研究證實，SLE患者和狼瘡易感小鼠的B細胞均發生異常，且SLE活動期B細胞數量明顯減少，但關于活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細胞數量的變化存在爭議。CD19是B細胞特異性的表面標志。為此，我們采用CD19抗體標記，用流式細胞儀比較了活動期MRL/lpr狼瘡小鼠與正常C57/B6小鼠脾臟中CD19陽性 B細胞的數量，結果表明活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細胞比例明顯低于正常的C57/B6小鼠(P<0.01)，見圖2。

2.3活動期狼瘡機體中的B細胞早期凋亡比例增加，而晚期凋亡未改變為了確定活動期MRL/lpr狼瘡小鼠B細胞比例減少是否與細胞凋亡相關，我們用Annexin V和PI標記B細胞，并用流式細胞儀檢測。結果表明，活動期狼瘡機體中總的淋巴細胞凋亡比例明顯增加(P<0.05)，其中B細胞的凋亡顯著增加(P<0.01)。進一步分析發現，活動期狼瘡機體中B細胞的早期凋亡比例增加(P<0.01)，而晚期凋亡未改變(圖3)。

圖1　活動期狼瘡小鼠B細胞周期的S期增加Fig.1　S phase of cell cycle was increased in active lupus B cellNote: A-E.The G1，S and G2 phase of cell cycle were detected in the splenic B cells from normal and MRL/lpr mice by using flow cytometry.*.P<0.05.

圖2　活動期狼瘡小鼠機體中的B細胞比例下降Fig.2　Percent of spleenic B cell was decreased in active MRL/lpr miceNote: A-B.The percent of CD19+B cells in spleenic lymphocyte was detected in normal and MRL/lpr mice by flow cytometry.*.P<0.01.

2.4小鼠脾臟B細胞各亞群分析B細胞的分類相當復雜，CD138一般被認為是漿細胞的標志，IgD 是成熟B細胞的標志，IgM是未成熟B細胞的標志。我們的結果表明，與正常小鼠相比，活動期狼瘡機體中漿細胞凋亡的比例沒有變化，而未成熟和成熟B細胞的凋亡明顯增加(P<0.01)，見圖4。

2.5MRL/lpr 小鼠B細胞抗凋亡基因表達降低，而促凋亡基因表達增加凋亡是多基因嚴格控制的過程，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同。至今對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識還是不全面的。我們僅僅檢測了一些細胞凋亡的基因，結果表明，與正常小鼠相比，活動期狼瘡小鼠B細胞中細胞凋亡蛋白抑制劑家族成員BIRC3明顯降低(P<0.01)，而Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加(P<0.01)，見圖5。細胞凋亡相關基因表達變化無差異的數據沒有提供。

圖3　活動期狼瘡小鼠B細胞早期凋亡比例增加，而晚期凋亡未改變Fig.3　Percent of early apoptotic B cells were increased in active MRL/lpr mice,while not late apoptotic B cellsNote: A.The percent of apoptotic cells in mouse spleenic lymphocyte；B.The percent of apoptotic B cell in mouse spleen；C-E.The percent of early and late apoptotic B cells in mouse spleen.*.P<0.01.

圖4　小鼠脾臟B細胞各亞群凋亡分析Fig.4　Apoptotic cells in each B cell subpopulation of mouse spleenNote: A.The apoptotic percent of CD138+B cells,IgM+B cells,and IgD+B cells in mouse spleen；B.Flow cytometry analysis of the apoptotic B cell subpopulation.*.P<0.001.

圖5　Q-PCR法檢測正常和MRL/lpr小鼠脾臟B細胞中BIRC3、BCL2L1和BBC3的表達差異Fig.5　Gene expression differences of BIRC3,BCL2L1 and BBC3 were detected in B cells from normal and MRL/lpr mouse spleen by Q-PCRNote: Expression of anti-apoptotic gene was decreased in MRL/lpr mice,while pro-apoptotic gene was increased.*.P<0.01，**.P<0.001.

3討論

許多研究證實，SLE患者B細胞發生異常，且狼瘡活動期B細胞數量明顯減少[3,4]，但一些研究發現SLE患者外周血中凋亡的細胞主要是T細胞[5]；活動期SLE患者的T細胞凋亡頻率與病程密切相關，而B細胞凋亡不受疾病活動的影響[6]。可見，狼瘡活動期B細胞數量明顯減少是否與其凋亡相關仍有待闡明。MRL/lpr狼瘡小鼠的癥狀與人類SLE相似。一般認為，MRL/lpr小鼠中含有與細胞凋亡有關的 Fas 基因隱性突變，導致 T細胞的死亡率降低和自身免疫反應加速[7,8]；MRL/lpr小鼠中Fas 基因突變不參與BCR誘導的成熟B細胞凋亡[9,10]。也有研究發現Fas參與B細胞不同發育階段的正常凋亡[11]。本研究中我們發現活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細胞比例明顯低于正常的C57/B6小鼠(P<0.01)(圖2)；活動期狼瘡小鼠機體中總的淋巴細胞凋亡比例明顯增加(P<0.05)，其中B細胞的凋亡顯著增加(P<0.01)。我們分析發現，活動期狼瘡小鼠機體中B細胞的早期凋亡比例增加(P<0.01)，且未成熟和成熟B細胞的凋亡明顯增加(圖4)。已有研究報道，在NZB/W F1狼瘡小鼠和 BALB/c小鼠之間，活化誘導的B細胞凋亡是相似的[13]；MRL/lpr狼瘡小鼠中IFN-α能夠上調死亡結構域相關蛋白6 導致B淋巴細胞減少[12]。事實上，活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中許多細胞參與狼瘡的發生和發展[14]，提示異常的細胞因子表達可能在MRL/lpr狼瘡小鼠的活化B細胞凋亡中發揮了重要作用。

細胞凋亡可幫助調節B細胞的發育。Fas是一種細胞表面受體，其活化可引發一系列事件最終導致細胞凋亡。 在MRL-lpr/lpr小鼠中 Fas 是有缺陷的，其誘導細胞凋亡的能力可能降低[15]。進一步研究發現，雖然抗原和抗原抗體復合物能誘導生發中心B細胞大量凋亡，但這種抗原和抗原抗體復合物誘導的B細胞凋亡與補體無關[16]。本研究中我們發現活動期狼瘡小鼠B細胞中細胞凋亡蛋白抑制劑家族成員BIRC3明顯降低，而Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加。一般認為，外源性和內源性細胞凋亡信號途徑參與自身免疫的發生。內源性細胞凋亡途徑由Bcl-2 家族蛋白介導。Bcl-2 家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[如BCL2L1和BBC3(PUMA)][17]。 BCL2L1和BBC3(PUMA)在許多刺激誘導的細胞凋亡中發揮重要作用[18]。BBC3(PUMA)是依賴T細胞的B細胞免疫應答中主要調節劑，調控記憶性B細胞的生存[19]。BIRC3屬于細胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)家族，能調節 caspase 活性、細胞分裂及細胞生存[20]。 因此，我們結果提示，活動期狼瘡小鼠B細胞的數目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，即抑制凋亡BIRC3的降低及促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)的增加。

綜上所述，本研究結果表明活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細胞比例明顯減少，而凋亡比例顯著增加；抗凋亡蛋白BIRC3明顯降低，而促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加。這些結果提示，活動期狼瘡小鼠B細胞的數目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，活動期SLE患者B細胞的減少可能與其早期凋亡相關。

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[收稿2015-07-01修回2015-08-13]

(編輯張曉舟)

Early apoptosis leads to decrease of B cells in MRL/lpr mice

LIBao-Hui,FANHong-Ye,LIUFei,RENDe-Shan,HOUYa-Yi，ZHOUChang-Lin.

StateKeyLaboratoryofNaturalMedicines,SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China

[Abstract]Objective:To explore the change of B cell numbers in active MRL/lpr lupus mice,and their regulation mechanisms.Methods: B cell cycle and the percent of B cells in spleen lymphocytes of active MRL/lpr lupus mice and normal C57/B6 mice were analyzed by using flow cytometry.The apoptotic B cells and their subclass were analyzed by Annexin V and PI staining.Further more,B cells were purified by magnetic sorting,and real-time quantitative PCR was carried out to detect apoptosis-related gene.Results: Compared with the C57/B6 mice,the percent of B cells in active MRL/lpr lupus mice were significantly reduced(P<0.01),while the percent of apoptotic cells were significantly increased(P<0.01).The percent of early apoptotic B cells were significantly increased(P<0.01)which including the immature and mature B cells,while the late apoptotic B cells were unchanged.Further more,we found that the anti-apoptotic protein BIRC3 was significantly reduced in active lupus B cells(P<0.01),while the pro-apoptotic protein BCL2L1 and BBC3(PUMA) were significantly increased(P<0.01).Conclusion: B cells in active lupus mice were significantly reduced while early apoptotic B cells were increased,which may be attributed to the changed balance between the anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins,suggesting the reduction of B cells in SLE patients may be related to their increased early apoptosis.

[Key words]B cell；Cell apoptosis；MRL/lpr lupus mouse

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0385-05

作者簡介：李寶輝(1989年-)，男，碩士，主要從事細胞與分子免疫研究，E-mail：cpulbh@126.com。通訊作者及指導教師：樊竑冶(1984年-)，女，博士，講師，主要從事細胞與分子免疫研究，E-mail：changqingshu2004@126.com。周長林(1964年-)，男，博士，博士生導師，主要從事抗生素藥效學研究，E-mail：cl-zhou@cpu.edu.cn。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.020

①本文為國家自然科學青年基金(8150060624)、江蘇省自然科學青年基金(SBK2015041401)、中央高校基本科研業務費專項資金培育項目(2015PY007)。

②南京大學醫學院和生物醫藥技術國家重點實驗室，南京210093。