色譜純化和質譜分析法研究牛骨源咸味肽

李迎楠++劉文營++張順亮++成曉瑜

摘 要：以牛骨為研究對象，通過中空纖維超濾裝置、Sephadex G-25凝膠色譜柱對相對分子質量小于5 000的酶解產物進行初步分離，選用制備型及分析型高效液相色譜分析儀對咸味肽進行純化、收集及分析。結果表明：收集得到牛骨源咸味肽為單一組分；用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀對咸味肽進行分析，得到其為相對分子質量均小于1 000的短肽，其呈現咸味的物質質荷比值可能為679.510 9。

關鍵詞：咸味肽；凝膠色譜；高效液相色譜；基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀

Separation， Purification and Analysis of Salty Peptides Derived from Bovine Bone by Chromatography and Mass Spectrometry

LI Yingnan， liu Wenying， ZHANG Shunliang， CHENG Xiaoyu*

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100068， China）

Abstract： The enzymatic hydrolysate of bovine bone with relative molecular weight < 5 000 was separated by hollow fiber ultrafiltration and Sephadex G-25 column chromatography. Two salty peptide fractions from the hydrolysate were purified by preparative high performance liquid chromatography （HPLC） and the pooled samples were analyzed by HPLC. The two fractions were found to consist of a single homogenous component. As analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）， both peptide fractions had a relative molecular weight less than 1000， the salty taste compound of which was m/z 679.510 9.

Key words： salty peptides； gel permeation chromatography； high performance liquid chromatography （HPLC）； matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006

中圖分類號：TS251.94 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）03-0025-04

引文格式：

李迎楠， 劉文營， 張順亮， 等. 色譜純化和質譜分析法研究牛骨源咸味肽[J]. 肉類研究， 2016， 30（3）： 25-28. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LI Yingnan， LIU Wenying， ZHANG Shunliang， et al. Separation， purification and analysis of salty peptides derived from bovine bone by chromatography and mass spectrometry[J]. Meat Research， 2016， 30（3）： 25-28. （in Chinese with English abstract）DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

食鹽是人類生存最重要的物質之一，也是烹飪中最常用的調味料，但是過多地攝入食鹽不僅與高血壓的發生有密切關系，也會對心、腦、腎等器官產生損害[1-2]。隨著現代科技的發展，使得安全健康的食鹽替代物的開發具有重要意義和前途[3]，咸味肽作為一種可呈現咸味的多肽，其來源于天然動植物，開發與應用前景廣闊，具有重要的社會意義和經濟價值。

近年來，國內外學者針對可呈現咸味的多肽開展了不少工作，Nakamura等[4]通過合成方法制備出無Na+存在的咸味肽，其具有能夠在食品加工時替代食鹽的潛力，但成本昂貴；Zhu Xiaolin等[5]在對無鹽醬油研究過程中發現3 種具有咸味的二肽，且其中兩種具有抑制血管緊張素轉化酶活性的功能；張順亮等[6]通過對比不同凝膠層析色譜分離得到咸味肽，結果顯示，其制備的咸味肽的相對分子質量可能為849.38 D，但咸味肽分離純化效果并不理想。目前超濾裝置及制備型高效液相色譜儀被廣泛應用于多種物質單體的制備，特別是制備型高效液相色譜儀具有分離效率高、產物純度高、分離速度快等特點，是制備純化天然產物的極好手段[7-8]。

本研究利用食品級生物酶試劑對粉碎后牛骨進行酶解，通過逐級純化酶解液最終得到咸味肽，選用超濾膜過濾、Sephadex G-25凝膠色譜、制備型高效液相色譜儀對凍干后咸味組分進行純化并收集，采用高效液相色譜儀對其進行純度鑒定，并利用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MOLDI-TOF/MS）對其成分進行分析，為咸味肽開發利用提供技術支持，尤其是為咸味肽應用于食品加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨 北京豐臺牛街清真市場；復合動物蛋白酶、風味蛋白酶 諾維信（中國）投資有限公司；葡聚糖凝膠G-25 美國Pharmacia公司；甲醇（色譜純） 美國Merck公司。

1.2 儀器與設備

強力破骨機 廊坊惠友機械有限公司；YXQGO2型電熱式蒸汽消毒器 山東新華醫療器械；JJ-1精密定時電動攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司；CL-25型蠕動泵中空纖維超濾膜組件 北京旭邦膜設備有限責任公司；SL-Ⅲ型數控層析冷柜 北京博翔興旺科技有限公司；LGJ-30D冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；Waters LC 2695-2998分析型液相色譜儀、Waters LC 2545-2998制備型液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；4700 MOLDI-TOF/MS質譜聯用儀 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 咸味肽粗提物制備

參考文獻[6]方法并稍作修改。取新鮮牛骨，去肉、粉碎、除脂，取骨渣進行酶解，酶解溫度為60 ℃，骨渣與水質量比為1∶1，添加復合動物蛋白酶15 mg/g（骨渣），酶解2 h；然后添加風味蛋白酶10 mg/g（骨渣），酶解4 h，酶解期間持續攪拌；將酶解液真空抽濾后，用截留相對分子質量為5 000的超濾膜過濾，收集濾液真空冷凍干燥，即為咸味肽粗提物，將咸味肽粗提物透析除鹽后備用。

1.3.2 咸味肽凝膠柱色譜分離純化

稱取Sephadex G-25 30 g，加入300 mL超純水，室溫下過夜使其充分溶脹，除去多余的水及細小顆粒，反復洗滌2～3 次，真空抽濾除去氣泡[9-10]，灌柱后用洗脫液平衡柱子，自動部分收集器收集時間為5 min。將分離得到的組分經多次收集后凍干，進行咸味感官評定。

Sephadex G-25凝膠色譜柱分離條件為：玻璃柱（60 cm×16 cm），進樣量質量濃度50 mg/mL，進樣量1 mL，流速為0.8 mL/min。洗脫液為超純水，

λ為220 nm。

1.3.3 咸味肽制備型液相色譜分離及收集

將凍干后咸味肽制成溶液，經0.45 μm濾膜過濾后備用。制備型液相色譜分離條件為：色譜柱為C18柱（10型250 mm），采用超純水-甲醇（95∶5～90∶10（V/V））為流動相進行梯度洗脫20 min，樣品質量濃度50 mg/mL，進樣量體積為1 mL，流速為5 mL/min，λ為220 nm，柱溫25 ℃。

1.3.4 咸味肽分析型液相色譜純度鑒定

將制備型液相色譜收集得到的咸味肽凍干后制得溶液，經0.45 μm濾膜過濾后備用。分析型液相色譜鑒定條件為：色譜柱為C18柱（4.6型250 mm），樣品質量濃度1 mg/mL，進樣量體積為10 μL，流速為1 mL/min，其余條件同1.3.3節。

1.3.5 咸味肽MALDI-TOF/MS分析

數據的采集：取0.5 μL樣品點靶室溫下自然風干后，將0.5 μL、5 mg/mL基質α-氰基-4-羥基肉桂酸（溶于50%乙腈溶液）點在樣品上自然風干。實驗前需在設定的質量范圍內用混合蛋白標準品進行質量校正，以保證獲得數據誤差小于5[11]。

質譜儀器參數：YAG激光器（355 nm）離子源，采用正離子反射模式檢測，加速電壓20.00 kV，掃描范圍：600～3 000 m/z，質譜信號為2 000 次激光點累加所得[12-13]。

1.3.6 感官評定

咸味肽組分咸味判定：將收集得到的不同峰組分分別凍干，制成1 mg/mL溶液，作出感官評定，判斷不同峰組分是否有咸味[14]。

2 結果與分析

2.1 咸味肽凝膠柱Sephadex G-25分離及咸味判定結果

凝膠柱Sephadex G-25的分離范圍是1 000～5 000 D，且具有較好的脫鹽作用[15]，將超濾后凍干樣品進行凝膠層析色譜分離，由圖1可知，超純水為洗脫液可得到5 個色譜峰，峰之間距離適中，分離效果較好。其中組分Ⅳ的響應值最大，峰Ⅳ較窄且峰型較尖、高，但峰Ⅱ較寬，比較圓滑，峰型不太理想[16]，收集得到峰Ⅱ溶液顏色較深，考慮為樣品中的雜質色素。凝膠層析色譜是根據被分離物質分子質量大小不同而進行分離，若相對分子質量較為接近，則單峰中可能含有多種物質，因此，需對得到的組分進行進一步分離。

將分離得到的5 種組分進行多次收集，冷凍干燥制成干品。分別對5 種組分進行感官評定，由表1可知，經過凝膠柱Sephadex G-25分離的組分中，組分Ⅳ有咸味，其他組分均無咸味。

2.2 咸味肽高效液相色譜純化結果及純度分析

制備型高效液相色譜圖譜與咸味肽的純度有直接關系，同時可通過不斷改變洗脫梯度、樣品濃度等使得峰型得到改善[17]。將凝膠柱Sephadex G-25分離得到組分Ⅳ配制成溶液，過濾后進行制備型高效液相色譜分析。由圖2可知，該組分分離出多種物質，經多次進樣收集洗脫液，凍干后經感官評定，可知呈現咸味的多肽集中于第2～3峰，其余峰組分凍干后無咸味，故在后續的收集中，著重收集前4個峰。多次實驗發現，中間兩個峰具有一定的關聯，現有工藝條件未實現完全分離，且響應值較高，說明咸味肽在該組分中為主要物質。

將制備型高效液相收集得到的第2～3峰組分分別凍干后配制成溶液a和b，過濾后利用分析型高效液相色譜分別對其進行純度分析[18]。由圖3可知，二者均為單一峰，組分的保留時間分別為2.538 3 min和2.533 3 min，結合制備型高效液相色譜結果，可以推斷出二者可能是一種物質的同分異構體。經歸一化定量，其純度均在98%以上，此時流動相甲醇的體積分數約為5.5%，實驗得到的咸味肽具有較強的極性。

2.3 咸味肽MALDI-TOF/MS質譜分析結果

MALDI-TOF/MS在分析多肽混合物時，能耐受適量的緩沖劑、鹽等物質。不同多肽在MALDI源離子化過程中離子化效率不同，相互之間存在競爭，因此可能存在一些多肽因離子化抑制而未被檢測到，同時MALDI-TOF/MS質譜中檢測到的峰也可能是一些肽段峰的加鉀峰[19-20]。采用MALDI-TOF/MS對制備型HPLC收集到的第2組分進行質譜分析，其一級質譜結果見圖4。分離純化得到的咸味肽組分均為相對分子質量小于1 000的短肽，在質荷比（m/z）600～3 000之間，咸味肽中信號較強的母離子為612.849 4、622.047 0、679.510 9、701.497 4、792.601 8，結合咸味肽為該物質中的主要物質，初步判定咸味肽的質荷比值可能為679.510 9，但不排除所檢測物質中含有其他可呈現咸味多肽的可能性。

3 結 論

凝膠柱Sephadex G-25可分離得到5 個色譜峰，其中組分Ⅳ的響應值最大，峰型較好，且經感官評定，組分Ⅳ有咸味，其他組分均無咸味；對組分Ⅳ進行制備型高效液相色譜分析，得到多種物質，其中呈現咸味的多肽集中于第2～3峰，且兩個峰具有一定的關聯；分別對其進行純度分析，發現二者均為單一峰，保留時間分別為2.538 3 min和2.533 3 min，可以推斷二者是一種物質的同分異構體，且該物質具有較強的極性。

采用MALDI-TOF/MS質譜分析，得到的咸味肽組分均為相對分子質量小于1 000的短肽，結合咸味肽為該物質中的主要物質，初步判定咸味肽的質荷比值可能為679.510 9。實驗豐富了天然產物咸味肽的品類，為牛骨源咸味肽的開發提供了理論依據和技術支持。

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